Flujo de aerosolización, bio.

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 809 (2023) Citar este artículo

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Se sabe poco sobre la capacidad de propagación de Limnomonas gaiensis en los lagos de agua dulce del norte de Europa. En este estudio, mostramos que la especie podría aerosolizarse con éxito desde fuentes de agua mediante el estallido de burbujas (2-40 partículas.cm-3), independientemente de su densidad en la fuente de agua o de la velocidad del chorro utilizada para simular la rotura de las olas. La viabilidad de la especie se vio afectada tanto por las turbulencias del agua como por la aerosolización. La tasa de supervivencia de las células emitidas fue baja, específica de la cepa y se vio afectada de manera diferente por los procesos de destrucción de burbujas. La entidad "microalgas y biontes" podría producir etanol y nuclear activamente proteínas activas de nucleación de hielo soluble mediadas por hielo (principalmente ≤ −18 °C), lo que podría afectar potencialmente el smog y la formación de nubes. Además, las cepas más pequeñas podrían afrontar mejor los factores estresantes aplicados. La supervivencia a la exposición a corto plazo a temperaturas de hasta -21 °C y a eventos de congelación sugiere además que L. gaiensis podría dispersarse en el aire y contribuir a su deposición.

La microalga Limnomonas gaiensis habita en lagos de agua dulce del norte de Europa. Este miembro del filogrupo Chlamydomonas ha sido descrito recientemente morfológica y genéticamente1. La especie ha sido aislada de sistemas acuáticos desconectados en el norte de Europa1 y presenta características clave para la dispersión del organismo y la adaptación local caracterizadas por un potencial para aclimatarse a un amplio rango de pH2. Sin embargo, se desconoce su capacidad de difusión.

Se han reportado especies de Chlamydomonas transportadas por el aire en una amplia gama de ubicaciones geográficas3, con dispersión exitosa4,5,6 incluso en la especie de nieve C. nivalis7. Debido a la distancia y la ausencia de conectividad hídrica entre los lagos donde se encuentra L. gaiensis, planteamos la hipótesis de que la dispersión del aire puede desempeñar un papel en su propagación.

Las microalgas acuáticas se convierten en aerosoles mediante la abrasión de la superficie del agua3, mediante la fricción del viento y la rotura de las crestas de las olas generando gotas de espuma8, o mediante el estallido de burbujas que producen una película o gotas de chorro. Se ha informado sobre la aerosolización de microalgas en tierra y océano, con variaciones según la ubicación, las condiciones del viento3,9, la densidad de organismos en la fuente de agua y las condiciones de crecimiento10,11. Hasta la fecha, se dispone de menos de un puñado de flujos de emisión4,12,13,14, alcanzando hasta 3 × 103 células.m-3 en microalgas y 4 × 105 células.m-3 en picomicroalgas (0,2-2 µm). Además, los procesos que rigen la aerosolización de microalgas aún están mal caracterizados.

La aerosolización de microalgas ha retenido la atención debido a su capacidad de interactuar con la atmósfera, adaptarse morfológicamente para sobrevivir a las condiciones atmosféricas15, dispersarse a nuevos ambientes y ser una fuente de riesgos sanitarios para el medio ambiente y la sociedad3,9,16. La proliferación de microalgas en el aire, como Chlamydomonas spp.16, puede provocar graves problemas medioambientales y sanitarios tanto en interiores16,17 como en exteriores3,9,18. Además, algunas pueden proliferar en lagos contaminados por cianobacterias tóxicas6, similar a L. gaiensis1.

Las microalgas pueden producir compuestos orgánicos volátiles (COV) que son importantes para la química atmosférica19,20,21,22. También pueden nuclear hielo activamente desde menos de -6 °C mediante la producción de compuestos activos de nucleación de hielo (INA)23 y desde menos de -23 °C mediante la producción de exudados de INA24. Más concretamente, determinadas Chlamydomonas sp. puede nuclear activamente hielo25 a una temperatura comprendida entre −8 y −17 °C. Por lo tanto, los COV de microalgas y las moléculas de INA producidos pueden tener un impacto potencial en procesos atmosféricos como la formación de nubes y su propia deposición.

No se espera que las microalgas en aerosol permanezcan en el aire durante períodos prolongados debido a su tamaño típicamente grande3. Por esta razón, se pensaba que su impacto sobre el clima y la expansión del transporte aéreo era insignificante. Sorprendentemente, se han reportado algunas microalgas alejadas de sus fuentes potenciales, incluso en lugares remotos como la Antártida3,26,27,28. Además, utilizando el análisis de trayectoria inversa, los estudios han demostrado que el transporte largo y viable de microalgas era factible15,29,30,31. El largo transporte aéreo genera varias oportunidades de interacción con la radiación solar y aumenta su potencial para actuar como los llamados núcleos de condensación de nubes gigantes (CCN), que forman la semilla para la formación de gotas de nubes líquidas. El papel de las microalgas transportadas por el aire como CCN gigante se ha sugerido anteriormente28, pero hasta ahora no se comprende bien.

Este estudio tiene como objetivo inferir si L. gaiensis puede emitirse a la atmósfera mediante procesos de destrucción de burbujas y hacer frente al estrés asociado con la emisión, e identificar compuestos bióticos que podrían influir en los procesos atmosféricos. Investigamos su (i) capacidad de aerosolización (es decir, magnitudes relativas de los flujos de aerosolización) para diferentes tipos de chorros, (ii) efecto sobre la química atmosférica (es decir, producción de COV y de compuestos activos de nucleación del hielo desde −4 hasta −21 ° C), y (iii) capacidades viables después de eventos de aerosolización y congelación. Los resultados de nuestro estudio pueden proporcionar conocimientos novedosos sobre la dispersión de microalgas y su papel como partículas biológicas primarias de aerosol (PBAP) en la atmósfera.

En un estudio piloto (Experimento (Exp) 1–2, Tabla 1), investigamos el impacto del estallido de burbujas (Chorro único (SJ) versus Chorros múltiples (MJ)), a diferentes intensidades de flujo de agua (SJ7, SJ9, MJ5, MJ3), sobre la emisión de VR66-07 y R86-47. En todos los escenarios, los resultados mostraron que las microalgas se aerosolizaron con éxito mediante el estallido de burbujas.

La medición directa del conjunto de microalgas (EM) emitidas (es decir, células, fragmentos de células y otro material de microalgas) se estimó utilizando el espectrómetro óptico de partículas (OPS) (Figuras complementarias 1 y 2). Los datos de Exp1 se excluyeron del análisis del flujo de emisiones debido a un mal funcionamiento en la bomba OPS. Exp2 mostró una emisión constante de partículas en aerosol a lo largo del tiempo en SJ y MJ. Los caudales SJ9 y MJ3 produjeron las mayores concentraciones de partículas emitidas (Figura complementaria 2). A la luz de estos resultados, aplicamos SJ9 y MJ3 a los experimentos sucesivos.

La abundancia de EM, capturada en filtros durante Exp1-2, se evaluó utilizando muestras fijadas con Lugol. En todas las muestras fueron visibles numerosos fragmentos celulares. Inesperadamente, el número de EM intactos fue mayor después de SJ (2467 células ± 336) que después de MJ (1800 células ± 255) (ANOVA unidireccional F(1,6) = 10,0, p = 0,020), en ambas cepas (F (1,6) = 0,67, p = 0,45). Sospechamos que la presión de filtración pudo haber dañado la integridad del EM y afectado los resultados. Para evitar sesgos, se utilizó una técnica alternativa en fase líquida en Exp5-7 para capturar EM.

La estimación indirecta del número de EM se calculó a partir de muestras fijadas con Lugol recolectadas del tanque de agua (Figuras complementarias 1 a 3), lo que muestra una disminución significativa en la abundancia de microalgas acuáticas (−73,8% ± 0,4 células en promedio; Kruskal-Wallis X2(4) = 21,94, p < 0,001, prueba de Dunn p < 0,001), en ambas cepas (X2(1) = 0,004, p = 0,95). A pesar de que el porcentaje de EM después de MJ (51,2% ± 19,9) fue mayor que después de SJ (41,7% ± 22,9), no hubo diferencia significativa entre ambos tratamientos (prueba de probabilidad exacta de Fisher, p = 0,26), posiblemente debido a la alta desviación estándar obtenida de los recuentos. Se conocen las discrepancias con respecto a los recuentos de Lugol a lo largo del tiempo32 y, por lo tanto, se utilizó un enfoque más sistemático para estimar las abundancias, por ejemplo, contando réplicas de una fase de muestra en un día y aplicando los mismos factores de dilución para todas las réplicas.

Los datos de OPS confirmaron que ambas cepas se emitieron bajo SJ9 y MJ3 (Tabla 1 y Fig. 1). La concentración total del conjunto EM osciló entre 2 y 40 partículas.cm-3 y fue relativamente constante en todos los tratamientos y cepas (Fig. 1). Los flujos de emisión, que oscilaron entre 0,8 y 7,9 × 10-4 m-2.s-1, fueron comparables entre las dos cepas (ANOVA unidireccional F(1,10) = 2,16, p = 0,17) y fueron sistemáticamente, pero sólo marginalmente significativamente más pequeño bajo SJ9 (2.4 × 10-4 m-2.s-1 ± 1.3 × 10-4) que MJ3 (4.8 × 10-4 m-2.s-1 ± 2.4 × 10-4) (Fig. 1, Kruskal-Wallis X2(1) = 3,69, p = 0,055). Además, no hubo una relación clara entre el flujo de emisiones y la abundancia de microalgas en el tanque de agua (Figura complementaria 4).

La serie temporal que ilustra la concentración total de partículas aerosolizadas (a, c) bajo los tratamientos SJ9 (azul) y MJ3 (naranja) en dos cepas de Limnomonas gaiensis, es decir, VR66-07 (a, b) y R86-47 (c, d), en el Experimento 2 (cruces), Experimentos 3 y 4 (círculos), Experimentos 5 y 6 (triángulos invertidos) y Experimento 7 (triángulos invertidos). Además, se ilustra el flujo medio para cada una de las dos cepas (b,d), para ambos tratamientos, junto con una desviación estándar que denota la variabilidad en el tiempo (n = 52–58).

El número medio de EM capturados por los filtros (fase sólida y seca, Exp1-4) fue de 2586 células (± 876), y se observaron numerosas células rotas y desechos. El número de células capturadas no difirió significativamente entre los tratamientos (Kruskal-Wallis X2(1) = 0,53, p = 0,47), ni entre las cepas (ANOVA unidireccional F(1,10) = 1,04, p = 0,33). El número de EM capturados por los impingers (fase líquida, Exp5-7) fue al menos 10 veces mayor que el uso de filtros (Tabla 1), con pocas o ninguna celda rota visible. Sin embargo, la proporción de células capturadas por los dos dispositivos fue bastante similar ya que la abundancia de microalgas en la fuente de emisión fue> 10 veces mayor en Exp5–7 que en Exp1–4 (Tabla 1). El número de células capturadas por los impingers no difirió significativamente entre tratamientos (Kruskal-Wallis X2 (1) = 0,017, p = 0,90), pero sí entre cepas (Kruskal-Wallis X2 (1) = 14,63, p <0,001).

La medición indirecta confirmó la aerosolización de ambas cepas desde la fuente de agua con 32,8% (± 24,6) de EM. A pesar de una tasa de EM ligeramente mayor bajo SJ (41,1% ± 25,1) que MJ (24,5% ± 23,3), esta emisión no se vio afectada significativamente por la elección del tratamiento (ANOVA de dos vías F(1,8) = 1,21, p = 0,30) ni por cepas (F(1,8) = 0,58, p = 0,47), ni por cepas y tratamiento (F(1,8) = 0,062, p = 0,81). La fluctuación en la abundancia de microalgas en el tanque de agua (Tabla 2) no se vio afectada significativamente por los tratamientos (Kruskal-Wallis X2(1) = 2,37, p = 0,12) o cepas (X2(1) = 0,009, p = 0,93). Se observaron fluctuaciones notables en la abundancia de microalgas en el tanque de agua entre experimentos (Kruskal-Wallis X2(6) = 32,59, p < 0,001) como resultado de diferentes cargas de microalgas en el tanque de agua (X2(4) = 38,99, p < 0,001 ), en particular entre Exp1–4 y Exp5–7 (Prueba de Dunn p < 0,05). Cuando se cargaron 107 células en el tanque (Exp1–4), la abundancia de microalgas en el tanque de agua se mantuvo mayor bajo SJ que MJ (Kruskal-Wallis X2(1) = 12,81, p < 0,001), lo que resultó en flujos de emisión más bajos bajo SJ , como se observa en los datos de OPS (Fig. 1). Sin embargo, cuando se cargaron mayores abundancias de microalgas (Exp5-7), no hubo diferencias significativas entre los tratamientos (Kruskal-Wallis X2(1) = 0,11, p = 0,74), a pesar de que el OPS registró flujos sistemáticamente más altos bajo MJ (Fig. .1).

El biovolumen de la cepa se estimó a partir de la fuente de agua y los filtros (Exp2-4, Fig. 2) para investigar si la selección de tamaño ocurrió durante la emisión. Ambas cepas mostraron la misma tendencia en todos los experimentos (cepas ANOVA de dos vías: F(1,6) = 2,60, p = 0,16, experimentos: F(1,6) = 0,036, p = 0,86). Se observó una disminución significativa en el biovolumen entre el iniciador (cultivo original) y los tratamientos (F(4,6) = 11,91, p = 0,0051). El biovolumen celular no fue afectado por SJ o MJ en organismos recolectados en filtros (TukeyHSD p = 0,99) ni en el tanque de agua (TukeyHSD p = 0,99). Pero se observó una diferencia en el biovolumen entre las cepas bajo tratamiento (ANOVA unidireccional F(1,8) = 6.374, p = 0.036), con un biovolumen promedio más pequeño en R86-47 (24.0 µm3 ± 11.6) que en VR66-07 ( 42,3 µm3 ± 10,5).

Diagrama de caja de los valores de biovolumen medidos en dos cepas de L. gaiensis: VR66-07 (Experimento 4) y R86-47 (promedio de los Experimentos 2-3). El número de observaciones está comprendido entre 6 y 50 por cepa y tratamiento. Se observaron diferencias significativas entre las cepas a lo largo del experimento (a vs b, p = 0,036).

Para comprender las limitaciones del tratamiento y la recaptura del potencial de dispersión aérea de L. gaiensis, se investigó la capacidad de reactivación de EM. Ninguno de los inoculos recolectados de los filtros pudo revivir o mostrar signos vitales (crecimiento o movimiento) en condiciones que favorecieran el crecimiento durante un período de incubación de dos meses. En cambio, se vieron numerosas células fragmentadas y escombros. Los resultados sugirieron que solo una pequeña proporción de ME puede ser viable, o que los ME se vieron afectados negativamente por la presión de filtración.

Los inóculos recolectados de impingers mostraron un éxito de supervivencia del 10,4% (± 4,8; 57/548 inoculados), lo que sugiere que la captura en fase líquida puede romper menos células y que una pequeña porción de las cepas de microalgas podrían dispersarse en el aire. Las dos cepas reaccionaron de manera diferente a los tratamientos de explosión de burbujas, con una tasa de supervivencia menor en VR66-07 (4,9%; 9/184 inoculados; Exp5) que en R86-47 (13,2% ± 1,0, Exp6-7; 48/364 inoculados). (Prueba Z X2(1)Exp5-Exp6 = 5,78, p = 0,016; X2(1)Exp5-Exp7 = 7,67, p < 0,01). Más específicamente, se observaron diferencias significativas para MJ (VR66-07: 0% (0/92 inoculados) vs R86-47: 14,8% ± 0,5 (27/182 inoculados); prueba exacta de Fisher para datos de recuento pMJ < 0,0001), pero no SJ (VR66-07: 9,8% (9/92 inoculados) vs R86-47: 11,6% ± 2,5 (21/182 inoculados), cepas: 11,0% ± 2,1 (30/274 inoculados), prueba exacta de Fisher para datos de recuento pSJ = 0,81). Los resultados fueron reproducibles entre experimentos (X2(1)Exp6-Exp7 = 0,06, p = 0,81) y tratamientos (prueba Z X2(1)MJ < 0,001, p = 1,0; X2(1)SJ = 0,27, p = 0,61) .

La capacidad de supervivencia del organismo también se evaluó mediante tinciones vivas/muertas en muestras recolectadas del tanque de agua y después de la emisión. Se utilizó la tinción vital Rojo Neutro para inferir la proporción de organismos intactos. Tiñe eficientemente varios taxones de microalgas23,33 pero no tiñó adecuadamente L. gaiensis ya que la señal rojo anaranjado del tinte estaba enmascarada por la morfología del cloroplasto en forma de copa de microalgas, ocultando las señales debajo de las vacuolas y el citoplasma.

Se utilizó yodo propidio para evaluar la fracción de organismos muertos/dañados (Exp7, Tabla complementaria 1). El porcentaje de células muertas fue bajo en el iniciador (7,0% ± 0,5). Aumentó significativamente al 25,5 % (± 3,5) después de la homogeneización del agua (Prueba exacta de Fisher para datos de recuento p < 0,001) y permaneció constante en todos los tratamientos en la población acuática (SJ: 28,4 % ± 2,3, MJ: 27,9 % ± 1,6; Prueba exacta de Fisher Prueba para datos de recuento (phomogeneización-tratamiento = 0,87 y pSJ-MJ = 1,0). La dinámica de la aparición de células muertas investigada mediante citometría de flujo (Fig. 3) confirmó una disminución neta de la población de células intactas (fuera de la puerta) hacia células muertas (dentro de la puerta), principalmente después de la homogeneización del agua (Fig. 3a, b). lo que indica que la turbulencia del agua, independientemente de SJ o MJ (Fig. 3c, d), tuvo un impacto negativo en la supervivencia celular. El porcentaje de células muertas fue muy alto en la fracción emitida (97,1% ± 4,2), corroborando con la baja tasa de reactivación recuperada de los inoculados. Hubo una proporción marginalmente significativamente mayor de células muertas en SJ que en MJ (Prueba exacta de Fisher para datos de recuento p = 0,06). Sin embargo, esta tendencia debe tomarse con precaución porque el número total de células detectadas por el citómetro de flujo en la fracción emitida fue bastante bajo y se encontraba en el rango del umbral de detección.

Células muertas teñidas con yoduro de propidio (PI+; grupo a la derecha) con una indicación del porcentaje de células muertas entre las células que contienen clorofila (ntotal). Los tratamientos incluyen el cultivo inicial (a, ntotal = 0,9 × 109 células), después de la homogeneización con agua (b, ntotal = 1,6 × 109 células), después del tratamiento con SJ9 (c, ntotal = 2,4 × 109 células) y después del tratamiento con MJ3 (d , ntotal = 2,4 × 109 células).

La producción de COV es relevante por su efecto potencial sobre la química atmosférica (por ejemplo, el clima, la formación de nubes, ver Discusión). Durante las fases experimentales se investigaron las emisiones gaseosas de la entidad natural L. gaiensis (es decir, microalgas y biontes, ver Métodos). Se exploraron COV en el rango de m/z 21–200 y se encontró la emisión de m/z 47,05 (etanol) bajo estrés. A pesar de que el etanol se utiliza con fines de limpieza y su proporción de mezcla en el aire del laboratorio varió sustancialmente entre los experimentos, la entidad L. gaiensis pudo producir etanol bajo estrés (Fig. 4).

Los paneles a y c ilustran los resultados de dos experimentos con la cepa VR66-07 de Limnomonas gaiensis en los Experimentos 4 y 5, respectivamente, y los paneles byd muestran los resultados con la cepa R86-47 en los Experimentos 3 y 6, respectivamente. Sólo se detectó el VOC m/z 47,05 y corresponde a la señal protonada del etanol. Cinco fases diferentes de los experimentos están resaltadas en diferentes colores, por ejemplo, emisión del agua MilliQ (puntos grises, n = 212–1200), emisiones del agua MilliQ burbujeante (puntos negros, n = 757–2134), emisiones durante la primera mezcla ( homogeneización, puntos morados, n = 351–685), emisiones del tratamiento MJ3 (puntos naranjas, n = 3360–3720) y SJ9 (puntos azules, n = 3180–3670).

Las emisiones de etanol fueron bajas cuando el tanque se llenó solo con agua (controles de agua) y mayores cuando la entidad L. gaiensis estaba presente (tratamientos, Fig. 4). Se registró una fuerte disminución inicial en la concentración de etanol con el tiempo cuando solo había agua en el tanque (condición del agua, Fig. 4 Exp5-6), lo que refleja el reemplazo del aire del laboratorio en el espacio superior del tanque por aire filtrado. La señal de etanol aumentó fuertemente cuando los organismos se homogeneizaron (condición de mezcla, Fig. 4). Se observó un aumento constante en la emisión de etanol con SJ9, caracterizado por una pendiente de 0,006 ppb.s-1 (Exp3) y 0,040 ppb.s-1 (Exp6) en R86-47 y de 0,002 ppb.s-1 (Exp4). y 0,006 ppb.s−1 (Exp5) en VR66-07. También aumentó durante MJ3 en R86-47 con una pendiente de 0.001 ppb.s-1 (Exp3) y 0.03 ppb.s-1 (Exp6) pero permaneció constante en VR66-07.

La capacidad de la entidad L. gaiensis para nuclear hielo activamente se investigó mediante ensayos de congelación de gotas en cuatro cepas1. Los eventos de congelación y el número de partículas nucleantes de hielo (INP) (fracción total, Figs. 5, 6) se estimaron cuando se expusieron a un gradiente que abarcaba de -4 a -21 °C. Las cepas originadas en el lago Ryssbysjön comenzaron a congelarse a −8 °C, es decir, R86-45 a >−8 °C con 2,1 × 10−6 INP.cell−1 y R86-47 a <−8 °C con 3,3 × 10− 6 INP.celda-1. Las cepas del lago Västra Ringsjön estaban activas a temperaturas bajo cero, es decir, VR66-10 a <-17 °C con 2,5 × 10-5 INP.cell-1 y VR66-07 a <-18 °C con 8,2 × 10-6 INP.celda-1. En R86-47, la actividad de IN se mantuvo baja, entre −8 y −17 °C ( ≤ 3,9 × 10−6 INP.cell−1), a veces por debajo del límite de detección (<−12 °C) y comenzó a aumentar nuevamente a <−17 °C ( ≤ 1,5 × 10−4 INP.celda−1). En todas las cepas, la mitad de las réplicas se congelaron (fracción congelada (FF) de 0,5) desde -18 hasta -21 °C (Fig. 5). A -21 ° C, todas las réplicas se congelaron (FF = 1) en R86-45 (Fig. 5a). En las otras tres cepas (Fig. 5b-d), FF alcanzó 0,95 en VR66-10, 0,88 en R86-47 y 0,75 en VR66-07. A −21 °C el número de INP fue de 1,01 × 10−4 (± 0,4 × 10−4) INP.cell−1 en promedio, alcanzando 8,2 × 10−5 INP.cell−1 en R86-45, 1,5 × 10 −4 INP.cell−1 en R86-47, 5,2 × 10−5 INP.cell−1 en VR66-07 y 1,2 × 10−4 INP.cell−1 en VR66-10 (Fig. 6). Los resultados indicaron que la entidad L. gaiensis podría ser IN activa a temperaturas bastante bajas, casi insignificante en comparación con los INA PBAP conocidos (p. ej., P. syringae, nuestro control positivo, ≤ −6 ° C) y partículas abióticas (≤ −12 ° C). .

Las cuatro cepas investigadas de Limnomonas gaiensis, R86-45 (a), R86-47 (b), VR66-07 (c) y VR66-10 (d) expuestas a un gradiente decreciente de −1 °C de −4 a −21°C. La fracción total se indica en verde. Los tratamientos incluyeron desnaturalización de proteínas mediante calor (no proteico, naranja), selección del tamaño de la molécula mediante filtración en una membrana de poro de 0,22 µm (soluble, azul) o una combinación de ambos tratamientos (soluble no proteico, púrpura). El número de réplicas fue de 32 gotas de 20 µL de microalga (cepa), MWC (control negativo, negro) o Pseudomonas syringae activa >-4 °C (control positivo, gris). Las barras de error muestran el intervalo de confianza del 95%. Cada punto de datos es la síntesis de un total de 52 a 64 réplicas por cepa y tratamiento, y de 116 réplicas por control.

Las cuatro cepas investigadas de Limnomonas gaiensis, R86-45 (a), R86-47 (b), VR66-07 (c) y VR66-10 (d) expuestas a un gradiente decreciente de −1 °C de −4 a −21°C. Los datos se normalizan con respecto al control negativo. La fracción total se indica en verde. Los tratamientos incluyeron desnaturalización de proteínas mediante calor (no proteico, naranja), selección del tamaño de la molécula mediante filtración en una membrana de poro de 0,22 µm (soluble, azul) o una combinación de ambos tratamientos (soluble no proteico, púrpura). Las barras de error muestran el intervalo de confianza del 95% para 52 a 64 réplicas por cepa y tratamiento.

La naturaleza del componente responsable de la actividad IN se investigó mediante tratamientos térmicos y de filtración (Fig. 5). Hubo un efecto significativo de los tratamientos sobre la actividad de la cepa (Kruskal-Wallis X2(15) = 26,0, p = 0,04, Fig. 6), y en particular un efecto del calor (Prueba de Dunn p = 0,002), lo que sugiere que los compuestos de INA eran proteicos. Se realizó un tratamiento de filtración para descifrar si los compuestos proteicos de INA eran solubles (tamaño <0,22 µm). Las cepas R86-45 se vieron significativamente afectadas por el tratamiento de filtración (Figs. 5a y 6a, prueba de Dunn p = 0,03), lo que indica que sus compuestos INA no eran solubles. Sin embargo, en las otras tres cepas, el efecto de la filtración no fue significativo (Prueba de Dunn p = 0,24, p = 0,63, p = 0,61, respectivamente), lo que sugiere compuestos INA solubles (Figs. 5b – d y 6b – d). Cuando se calentaron tanto la fracción total como la soluble, hubo una caída significativa en la actividad de IN, por debajo de los límites de detección (Figs. 5-6), lo que confirma el origen proteico de los compuestos de INA. En resumen, los resultados indicaron que la actividad IN fue desencadenada por proteínas INA que eran solubles (R86-47, VR66-07, VR66-10) o asociadas a los organismos (R86-45).

Además, se investigó el pico de actividades IN en R86-47 entre −8 y −11 °C y en VR66-10 desde −12 hasta −17 °C (Fig. 6b, d). R86-47 fue sensible a la filtración (Prueba de Dunn p = 0,09) pero no al tratamiento térmico (Prueba de Dunn p = 0,41), lo que indica que sus compuestos INA eran no proteicos posiblemente asociados al organismo (p. ej., exudados). VR66-10 mostró actividad IN solo en la fracción soluble durante este intervalo de temperatura, pero no en la fracción total. Además, una reducción significativa de la actividad entre las fracciones solubles y calentadas solubles indicó que los compuestos solubles de INA eran proteicos (Kruskal-Wallis X2(1) = 8,25, p = 0,004, prueba de Dunn p = 0,004). Los resultados sugirieron que la presión de filtración en VR66-10 puede haber afectado la integridad de algunas células y haber liberado proteínas INA solubles en las fracciones filtradas.

La capacidad de reactivación de las cepas de L. gaiensis se investigó después de una exposición a un estrés térmico que disminuyó gradualmente hasta -21 °C y un período de incubación de hasta tres semanas en condiciones que favorecían el crecimiento. Las cuatro cepas pudieron soportar hasta 8 h de exposición a estas temperaturas bajo cero. Aproximadamente la mitad de las réplicas revivieron (183/384 réplicas). R86-47 mostró la tasa de supervivencia más alta (59–100%) y R86-45 la más baja (0–63%). Hubo una disminución general en el porcentaje de reactivación con el incremento en la abundancia de células (Figura complementaria 5). El porcentaje más alto de reactivación se observó en el "cultivo probado más joven", que tuvo la abundancia más baja (Tabla complementaria 2) y experimentó una fase de crecimiento exponencial (observación basada en el color). Curiosamente, un tercio de la reactivación (58/183 réplicas) se produjo en pozos que experimentaron congelación, lo que sugiere que las cepas de L. gaiensis podrían sobrevivir a eventos de congelación.

Este estudio reveló que L. gaiensis podría aerosolizarse desde fuentes de agua dulce mediante procesos de explosión de burbujas y sobrevivir a la aerosolización y la exposición a temperaturas frías, y que las partículas de microalga-bionte podrían reaccionar a las condiciones de aerosolización produciendo COV y nuclear activamente hielo a temperaturas cálidas bajo cero. Por tanto, L. gaiensis es un candidato potencial para el transporte y dispersión aéreos, con posibles efectos sobre los procesos atmosféricos. Proporcionamos, por primera vez, estimaciones de los flujos de emisiones de L. gaiensis.

Ya se ha informado anteriormente sobre la aerosolización de microalgas. Se detectaron especies similares a Chlamydomonas en muestras de aire, deposiciones de nieve y en tanques de agua artificiales después de la deposición de aire. En este estudio, demostramos que L. gaiensis podría aerosolizarse desde fuentes de agua mediante el estallido de burbujas utilizando uno o varios chorros. La concentración emitida del conjunto de microalgas fue constante y alcanzó hasta 4 × 107 células.m-3. Esta tasa de emisión es mucho más alta que los registros de tasas de emisión naturales en microalgas (≤3 × 103 células.m-3)4 y picomicroalgas (≤3,7 × 105 células.m-3)12.

Los flujos naturales a escala de lago son difíciles de calcular ya que se sabe poco sobre las concentraciones límnicas típicas de L. gaiensis o Chlamydomonas sp. Una de las razones es que las abundancias en los estudios límpicos a menudo se proporcionan como peso seco o biomasa34,35, mediciones cualitativas35 o datos binarios (presencia/ausencia) con información ecológica36. Las tasas de emisión se estimaron en estudios que utilizaron conjuntos de comunidades de fitoplancton naturales y simulados o enriquecimientos de cultivos cargados en tanques con concentraciones de microalgas de hasta ~103-107 células.mL-1, en los rangos superiores de las floraciones naturales de fitoplancton10,11,37,38. En nuestro estudio, utilizamos rangos de concentración similares que abarcan ~103-108 células.mL-1. En nuestros recuentos de células, notamos una menor emisión de microalgas (3,2%) en experimentos densamente poblados (1012 células, Exp5) que en fuentes de agua menos densas (~ 107 células, 44,8% de EM, Exp1–4). La abundancia contribuye, pero no explica completamente, la mayor tasa de emisión recuperada en L. gaiensis, lo que sugiere que otros factores intrínsecos y extrínsecos desempeñan un papel en la aerosolización de microalgas (p. ej., características de las gotas, tamaño del organismo, salinidad, crecimiento y condiciones del hábitat).

El potencial de aerosolización de partículas puede verse influenciado por las propiedades del organismo39. Las gotas de chorro pueden aumentar la concentración entre 8 y 307 veces la densidad de microalgas acuáticas disponibles y esta concentración es específica de cada taxón11. El tamaño del organismo puede influir, ya que las estimaciones de emisiones más altas se informaron en el picofitoplancton12. El crecimiento de organismos y la producción de exudados también pueden aumentar el número de aerosoles10. Los exudados cambian la viscosidad de la superficie del agua y podrían afectar la cantidad de gotas generadas40. A diferencia de muchos taxones de microalgas (p. ej., cianobacterias, diatomeas), L. gaiensis no es conocida por la producción de mucílagos o exudados1. Por lo tanto, una combinación del tamaño del organismo y la producción de exudado de la entidad de microalgas podría influir en la carga de densidad del organismo por gota y, por tanto, en su tasa de emisión. Esta hipótesis requiere más investigaciones, ya que no se investigó la carga de L. gaiensis por gota, quedando fuera del alcance de este estudio.

La concentración y el tamaño de los aerosoles generados pueden diferir según la técnica y la intensidad del factor estresante utilizado para producirlos41,42. En nuestro estudio, utilizamos la explosión de burbujas, una técnica de aerosolización conocida por producir una amplia distribución de tamaño y ser capaz de expulsar eficientemente microalgas hasta 13 cm en el aire37. Indujimos el estallido de burbujas utilizando chorros únicos y múltiples, y generamos burbujas que cubrían toda la superficie de agua del tanque. Pietsch et al.42 mostraron una correlación positiva entre la velocidad del viento (turbulencia del agua) y el flujo de microorganismos acuáticos aerosolizados. El número sistemático pero marginalmente menor de EM en SJ9 que en MJ3 sugiere que la emisión de microalgas sería mayor en condiciones comparables a la configuración de chorros múltiples. Si bien esta diferencia no fue significativa, la observamos tanto al investigar el conjunto completo de microalgas (datos de OPS) como al seguir la abundancia de células en el tanque de agua. Anteriormente se habían observado mayores emisiones usando SJ en comparación con MJ para el tanque usado al analizar agua que contiene sal marina sintética43. Los autores observaron un aumento constante en el flujo de partículas al aumentar la velocidad del agua, lo que no concuerda con los flujos constantes observados en este estudio cuando se utilizan microalgas de agua dulce (Figura complementaria 2).

Las microalgas en aerosol son propágulos candidatos para la dispersión en el aire. A lo largo de su viaje, están sujetos a diversos factores estresantes. Las turbulencias del agua generadas durante los experimentos de explosión de burbujas representaron la pérdida de aproximadamente una cuarta parte de la población acuática. La etapa de homogeneización condujo a una disminución neta del biovolumen celular medio y a un aumento de al menos un 18,5% en el número de células muertas. No se observaron células más grandes durante los tratamientos en las muestras acuáticas o en los filtros después de la aerosolización. En cambio, se veía una gran cantidad de células rotas y desechos en los filtros. Es posible que organismos más grandes hayan sido dañados por las presiones aplicadas tanto en el agua como en los filtros, o hayan sido eliminados de la superficie del agua por las turbulencias del agua, hacia el fondo del tanque de agua. Esto último se corrobora con simulaciones44 que muestran que, contrariamente a lo esperado, las partículas más grandes se sedimentarían más rápidamente bajo un flujo turbulento. Ross45 demostró que las partículas sedimentadas en una capa mixta superficial (SML) bien homogeneizada tienden a resuspenderse en el fondo de la SML, donde se producen turbulencias más altas. Aquí utilizamos un tanque de agua con un SML pequeño (~27,1–30,1 cm) y tomamos muestras de los 2 cm superiores. Sin embargo, los organismos de mayor tamaño y forma alargada tienen una mayor tasa de encuentro, facilitando la aglomeración y sedimentación46. Además, para evitar los efectos nocivos de una fuerte turbulencia, las especies móviles de fitoplancton tienden a evadir las capas turbulentas47. Por lo tanto, es posible que las células con mayor biovolumen sean lavadas y atrapadas en el fondo del SML, una exclusión natural facilitada por la tendencia de las microalgas a adherirse a partículas y superficies1.

Limnomonas gaiensis se seleccionó aún más negativamente durante la aerosolización, con aproximadamente el 97,6 % de las células muertas recuperadas de la fracción emitida. Una pequeña fracción de los mercados emergentes (2,4%) mantuvo su viabilidad, algunos de los cuales revivieron en condiciones que favorecían el crecimiento. Curiosamente, la tasa de supervivencia fue mayor cuando los organismos se recolectaron en fase líquida (~10,8%) que en la fase sólida-seca (0%). De manera similar, se encontraron tasas de recuperación más altas de microorganismos transportados por el aire cuando se utilizaba un impactador líquido en lugar de filtros48. En los filtros, la desecación y la osmólisis podrían haber reducido drásticamente las posibilidades de supervivencia. La técnica del impinger parecía ser menos destructiva, con pocas o ninguna célula rota ni restos. Esto sugiere que una proporción baja de L. gaiensis puede generar propágulos viables en el aire y que la duración de su transporte, es decir, el período de exposición del organismo a factores estresantes atmosféricos adicionales49, puede desempeñar un papel clave en la determinación de su capacidad y distancia de dispersión.

La supervivencia aérea de L. gaiensis se ve afectada por temperaturas bajo cero y, en ocasiones, por heladas. En un estudio anterior23, demostramos que las microalgas acuáticas y aéreas, entre las que se encuentra Chlorophyceae, pueden soportar temperaturas de hasta -28 °C. Limnomonas gaiensis podría tolerar una exposición gradual y más corta de hasta -21 °C y experimentar congelación (este estudio). A pesar de la selección negativa, algunos L. gaiensis podrían sobrevivir al estrés térmico durante el transporte aéreo y las deposiciones húmedas.

La supervivencia de la aerosolización a la dispersión puede depender de la cepa. Las microalgas transportadas por el aire pueden ajustar sus condiciones fisiológicas al medio ambiente, produciendo específicamente una pared celular más gruesa y carotenoides para hacer frente a la exposición a los rayos UV y al estrés por oxígeno reactivo15. Las cepas de L. gaiensis se vieron afectadas por los tratamientos de aerosolización, especialmente cuando se utilizaban chorros múltiples. Curiosamente, hubo una diferencia significativa en el número de EM entre cepas. Además, la cepa con el biovolumen más grande (VR66-07) tuvo la tasa de emisión más alta cuando la carga de microalgas era ~107 células, mientras que R86-47 no solo tenía el biovolumen más pequeño, sino que también demostró una tasa de emisión más alta cuando la carga de microalgas acuáticas era de ~107 células. la carga fue> 109 células y una mejor tasa de supervivencia tanto después de la emisión como de la congelación. Además, la tendencia negativa entre el porcentaje de organismos revividos y la condición de crecimiento de las microalgas (densidad, edad) sugiere que la abundancia celular y la fisiología pueden desempeñar un papel importante en la capacidad de supervivencia de la especie. La respuesta fisiológica bajo aerosolización y congelación difirió entre cepas, a pesar de la concentración del organismo y la fase de crecimiento. VR66-07 y R86-47 tuvieron capacidades de reactivación similares después de la exposición al frío (prueba Z X2(1) = 7,45, p = 0,006) y su entidad produce proteínas solubles de INA activas por debajo de -17 °C, mientras que R86-45 fue menos eficiente al afrontar la exposición a temperaturas frías (prueba Z X2(1)VR66-07-R86-45 = 20,58 y X2(1)R86-47-R86-45 = 42,98, p < 0,001, respectivamente) y su entidad produjo no Proteínas INA solubles activas desde −8 °C. Para descifrar los mecanismos detrás de la tolerancia de L. gaiensis a los factores estresantes atmosféricos, los resultados requieren investigaciones morfológicas y fisiológicas complementarias.

Aunque las estimaciones sugieren que la abundancia en el aire y el riesgo de invasión de L. gaiensis son bastante bajos, el complejo natural microalga-bionte podría influir, hasta cierto punto, en su entorno, produciendo COV y siendo IN activo a temperaturas cálidas bajo cero.

Las emisiones de los organismos acuáticos se han estudiado cuidadosamente, particularmente en lo que respecta a la producción de sulfuro de dimetilo50, una molécula que desempeña un papel en la formación de nubes cálidas (p. ej., hipótesis CLAW51,52). Nuestro estudio muestra que la entidad L. gaiensis puede producir bajas cantidades de etanol bajo estrés inducido por el estallido de burbujas. El etanol en fase gaseosa reacciona en la atmósfera con radicales hidroxilo para formar acetaldehído, contribuyendo así potencialmente a la formación de ozono y smog. Esta observación es de gran interés ya que las fuentes de etanol en la atmósfera siguen estando hasta ahora mal cuantificadas.

Curiosamente, encontramos concentraciones más altas de etanol liberado utilizando chorros simples que múltiples. El etanol se produce mediante la fermentación de polisacáridos de microalgas como glucógeno, celulosa y almidón, acumulándose este último en microalgas verdes (como Chlamydomonas sp.) en un 50% hasta un 70% de su peso seco53,54. La mejora de la acumulación de almidón puede activarse bajo la limitación de microelementos junto con el burbujeo de aire54, desviando energía del crecimiento celular55. El etanol puede servir como fuente de carbono para otros microbios y actúa en las microalgas como antioxidante o estimulante de la acumulación de metabolitos y para la producción de lípidos, ácidos grasos y biomasa56. Si bien el etanol puede ser beneficioso para las microalgas, también puede alterar el metabolismo celular, la respuesta al estrés oxidativo y el crecimiento. Este efecto depende de la especie y se ha monitoreado en diferentes taxones en el rango de 0,39 a 16 g L-1. En nuestro estudio, la concentración de etanol liberado en el aire fue baja (≤2 × 10-4 g L-1), lo que sugiere que el etanol sería más un mecanismo de defensa estimulante que un inhibidor de la actividad del organismo.

En la atmósfera, las propiedades de condensación de nubes y nucleación de hielo de las PBAP pueden favorecer la formación de nubes y la deposición húmeda28, afectando la distancia del transporte aéreo de microorganismos (incluidas las microalgas) a escalas geográficas3. Aunque son una minoría entre los aerosoles, los PBAP marinos emitidos, de un tamaño de 0,5 a 10 µm, pueden actuar como CCN gigantes, influyendo en la precipitación57. Además, en el pasado se ha informado de la nucleación de hielo en microalgas (ver artículos aquí), incluso en especies similares a Chlamydomonas. La entidad L. gaiensis podría nuclear activamente hielo a temperaturas ≤ −18 °C, provocada por proteínas INA solubles de un tamaño <0,22 µm (en 3/4 cepas). Su actividad se produjo a temperaturas similares a las de otras especies de microalgas acuáticas (-18 a -24 °C, por ejemplo, Peridinium aciculiferum y Microcystis sp.) con mayor eficiencia, provocada por un menor número de partículas IN (~ 10-5 INP.cell). −1 en L. gaiensis versus ~10−1–10−2 INP.cell−1)23. Sin embargo, esta actividad ocurrió a temperaturas más bajas que las reportadas en Chlamydomonas sp. (-8 y -17 °C)25. La baja actividad de IN detectada en R86-45 desde -8 °C (2,1 × 10-6 INP.cell-1) posiblemente fue provocada por proteínas INA unidas a células.

Como las microalgas viven en estrecha relación con sus biontes58, sospechamos que la entidad microalgal, en lugar de la microalga sola, se aerosoliza. Por lo tanto, es posible que las proteínas INA unidas a las células no fueran de origen microalgal sino que fueran producidas por los pocos procariotas adheridos a las células de microalgas o presentes en la ficosfera. Se ha propuesto que los biontes adjuntos puedan estar activos IN para la entidad59 o contribuir a la actividad IN de la microalga25. Sin embargo, los cultivos de microalgas axénicos y no axénicos pueden ser activos en los mismos rangos de temperatura23. Sería interesante realizar análisis del complemento del R86-45 para descifrar la fuente de activación.

La baja actividad observada en la entidad L. gaiensis sugiere que su contribución a los procesos atmosféricos es insignificante en comparación con las PBAP eficientes (activas desde −1 °C)60 y las partículas inorgánicas en general (<−15 °C)28,61 presentes en la atmósfera. Sin embargo, las propiedades de nucleación del hielo de la entidad L. gaiensis podrían conferir ventajas que contribuyan a su supervivencia y a reducir su tiempo de residencia en la atmósfera.

La distribución de Chlamydomonas sp. cubre una amplia gama de regiones biogeográficas alrededor del mundo3, pero se sabe muy poco sobre su abundancia atmosférica. Las concentraciones de microalgas en el aire suelen ser muy bajas, es decir, hasta 104 células.m-3 sobre el Océano Atlántico Norte14 y cientos de células.m-3 localmente9,62, a veces por debajo del límite de detección63. Sólo una fracción de los microorganismos emitidos puede permanecer en el aire (10% después de 4 días de la emisión), lo que permite viajes de larga distancia de hasta 104 km de eucariotas unicelulares de 0,5 a 5 µm14. Su emisión y la posibilidad de transporte a larga distancia pueden aumentar en condiciones que estimulen la emisión de pequeñas gotas42. Además, las presiones de selección ambiental, los factores de dilución durante la disipación y el transporte y los requisitos selectivos de las especies en los hábitats de agua dulce pueden seleccionar negativamente el conjunto de propágulos viables en aerosol. Los datos generados en el presente estudio pueden servir como insumos en modelos para evaluar el rango potencial de transporte de L. gaiensis. En conjunto, la capacidad de L. gaiensis para ser aerosolizado, para posiblemente producir etanol y moléculas de INA, para hacer frente a temperaturas frías, eventos de congelación y exposición microbiana incluso a especies tóxicas, para transportar biontes (informado aquí y en la literatura), y su potencial de propagación y aclimatación1,2, convierte a esta especie en un actor no despreciable en el medio ambiente y la sociedad9,16. El conocimiento disponible exige más investigaciones sobre las capacidades de supervivencia de L. gaiensis a los factores estresantes atmosféricos, su diversidad de biontes y una evaluación de la distancia viable de su dispersión de propágulos.

Cepas de la microalga de agua dulce Limnomonas gaiensis (VR66-07 y R86-47) originarias de lagos forestales en Suecia1 se cultivaron en medio MWC64 en una cámara climática controlada a 15 °C, con un régimen de 12 h de oscuridad: 12 h de luz y 50 µmol. fotones.m-2.s-1 intensidad de luz. Las cepas no eran axénicas (Fig. 7), imitando la entidad natural de la especie (es decir, microalgas y biontes). Los procariotas estaban presentes en el medio de cultivo, distribuidos como células individuales o como grupos de células; pocos estaban adheridos a L. gaiensis; y otros estaban presentes en su ficosfera. Se utilizaron dos cepas no axénicas adicionales (VR66-10 y R86-45), originadas en los mismos lagos forestales en Suecia1, para investigar el efecto de la exposición a temperaturas cálidas bajo cero (ver más abajo). Las cuatro cepas están disponibles en la Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Göttingen, Alemania (SAG 2636-2639).

a: VR66-07, b: R86-47, c: VR66-10 y d: R86-45. Barra de escala: 10 µm. Las células de microalgas aparecieron rojas debido a su autofluorescencia de clorofila y su ADN teñido de azul con DAPI. Los procariotas, de menor tamaño, aparecieron en azul mediante la tinción de ADN y en verde en b (sonda universal).

Se utilizó un tanque de acero inoxidable para investigar la aerosolización de la cepa que simula el estallido natural de burbujas, como se describe en la ref. 65. El tanque se llenó con 10 L de agua MilliQ (EMD Millipore, 18,2 MΩ.cm a 25 °C, 2 ppb de TOC). Las burbujas se generaron mediante un único chorro centrado de 4 mm (SJ) o mediante múltiples chorros (MJ) compuestos por ocho boquillas de 2 mm cada una. Los caudales de agua se establecieron en 6,0 y 6,2 L min-1 (SJ7 y SJ9, respectivamente, llamados así por la configuración de la bomba) en el tratamiento SJ y 8,7 y 11,4 L min-1 (MJ3 y MJ5, respectivamente) en el tratamiento MJ. Las velocidades del flujo se tradujeron en 8 ms-1 bajo tratamiento SJ y 6-7 ms-1 bajo tratamiento MJ43. Se cargó en el tanque una concentración de 106–1011 células de microalgas.L-1 (Tabla 1), imitando las concentraciones de microalgas que ocurren naturalmente en el lago durante una floración de Chlamydomonas sp.34 y utilizadas previamente en experimentos de aerosolización38. Los gases y partículas emitidos se tomaron muestras del espacio de cabeza (aprox. 5 L), por encima de la columna de agua.

Se midieron concentraciones continuas de partículas en aerosol en el rango de tamaño de 0,30 a 10 µm utilizando un espectrómetro óptico de partículas (OPS 3330, TSI, caudal: 1 L.min-1). Se colocó un secador de difusión de gel de sílice frente al instrumento para evaluar la concentración de partículas secas. Luego se utilizó la concentración total de partículas para calcular el flujo de emisión del "conjunto de microalgas" (es decir, células, fragmentos de células y otro material asociado a las microalgas). El flujo (F) se estimó utilizando la ecuación. 1, teniendo en cuenta el aire de barrido a través del sistema (Qair), la concentración total de partículas (NOPS) y la superficie del tanque (un tanque de 3,6 × 10−2 m2)43. No se consideraron los posibles efectos de pared y fondo. Los datos se analizaron utilizando el software AIM 10 (TSI).

Durante la duración de cada experimento (ver Tabla 1), se tomaron mediciones continuas de los COV en el rango m/z 21–200 usando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo de reacción de transferencia de protones (PTR-ToF-MS 4000, Ionicon Analytik ), operado en condiciones estándar con una relación E/N de 132 Td con un voltaje del tubo de deriva de 820 o 900 V, una presión del tubo de deriva de 3,3 o 3,4 mbar y una temperatura del tubo de deriva de 80 o 60 °C. El PTR-ToF-MS se conectó directamente al tanque analizando los COV en el aire sobre el agua (espacio de cabeza) con una resolución de 1 Hz. Los datos se analizaron con PTR-MS Viewer 3.2.12 (Ionicon).

La abundancia de microalgas en el tanque se evaluó a lo largo del tiempo y el tratamiento para tener en cuenta las emisiones de organismos en el aire. Se recogió un volumen de 1 ml de muestra acuosa por triplicado del tanque después de cada fase de tratamiento (es decir, iniciadores, tanque homogeneizado, SJ, MJ), se fijó en solución neutra de Lugol (concentración final del 4 %, Bie & Berntsen A/S, Dinamarca), homogeneizado y almacenado a 4 °C, en la oscuridad, hasta su posterior análisis. La abundancia de células se evaluó utilizando una cámara de recuento de vigas Sedgewick (S52, Graticules Optics Limited, Reino Unido) y un microscopio invertido (AXIOVERT 135 M, Zeiss), con un aumento de 100 o 200x.

Los organismos emitidos se recapturaron durante un período de 52 a 61 minutos en filtros (membranas hidrófilas de PTFE, 47 mm de diámetro, tamaño de poro de 0,20 µm, H020A047A, Advantec) conectados a una bomba con un caudal de ~2 L.min-1 o en 50 mL de MWC estéril utilizando un impinger (NS 29/32 25×250 mm, Assistant, Duran), siguiendo las recomendaciones de Grinshpun et al.66. Después del período de recolección, los filtros se subdividieron, en condiciones estériles. La mitad del filtro se resuspendió en 1 ml de medio MWC estéril y se fijó en solución de Lugol al 4% para evaluar la abundancia celular. Una cuarta parte del filtro se resuspendió en 0,5 ml de MWC estéril y se distribuyó en réplicas en microplacas estériles de 96 pocillos (Sarstedt, Alemania) llenas con 250 µl de MWC estéril y se incubó a 15 °C en condiciones de luz que favorecieran el crecimiento (como se mencionó anteriormente). ) hasta un período de dos meses. El último cuarto del filtro se almacenó a 4 °C en la oscuridad. Para el impinger, se fijó por duplicado un volumen de 2 ml de fase líquida homogeneizada en solución de Lugol al 4% y se almacenó a 4 °C en la oscuridad hasta la evaluación de la abundancia celular, y se envió por duplicado un volumen de 250 µL hasta 500 µL. en microplacas estériles de 96 o 48 pocillos (Sarstedt y Cellstart® Greiner Bio-one) respectivamente. Las placas inoculadas se cerraron con parafilm para evitar que los pocillos se sequen y se incubaron en una cámara de cultivo controlada a 15 °C, 12 h de oscuridad: régimen de luz de 12 h y 50 µmol de fotones.m-2.s-1 de intensidad de luz. Para evaluar la reactivación del organismo a lo largo del tiempo, los inoculados se controlaron hasta 2 meses de incubación utilizando un microscopio invertido. La reactivación y el crecimiento de los organismos se controlaron de forma regular y cualitativa para determinar la coloración celular, el movimiento celular (natación o movimiento del péndulo1) y la densidad utilizando un microscopio invertido (Axiovert 135 M, Zeiss).

El biovolumen de microalgas (B, µm3) se determinó siguiendo la ecuación. 267 para organismos esferoides alargados, considerando el ancho del organismo (W, en µm) y la longitud (L, en µm).

La viabilidad de las microalgas se probó utilizando tinción vital con rojo neutro para microscopía (72210 Sigma-Aldrich) usando una concentración final de 0,2 a 20 % y una solución de 1:50 000, siguiendo las recomendaciones de Zetsche y Meysman33 y el protocolo de Tesson y Šantl-Temkiv23. El tinte se acumula en el citoplasma y/o vacuolas de organismos vivos68 y proporciona una coloración rojo anaranjado a los organismos viables.

Además, la concentración de microalgas totales y de microalgas muertas sobre los tratamientos se estimó a partir de un volumen de 200 µL de cultivo homogeneizado y se analizó mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo NovoCyte 3000 equipado con un láser de 405 nm, 488 nm y 640 nm (Aligent, Santa Clara, California). Tenga en cuenta que el rendimiento y la estabilidad de los láseres y detectores NovoCyte se comprueban diariamente utilizando NovoCyte QC Particles (Agilent). En cada muestra, se utilizó un volumen de 1,5 µL de yoduro de propidio (PI; 1 mg.mL-1, Sigma) para teñir específicamente las células muertas. Todas las muestras se agitaron brevemente y se cargaron junto con los controles negativos (medio y agua destilada esterilizada en autoclave) en un cargador de 24 tubos. El análisis se realizó utilizando un caudal de 14 µL.min−1, un tiempo de muestreo de 1,26 min por muestra, una carga de volumen de 20 µL, una serie de 3 enjuagues entre cada muestra, una homogeneización de 1 ciclo por muestra con una velocidad de 1000 rpm durante 10 segundos, un umbral de dispersión hacia adelante para una altura establecida >50 000 y excitación con dos láseres a 405 nm y 488 nm. Debido a que la señal de ambos láseres era similar, aquí mostramos datos del láser de 488 nm para compararlos con la literatura disponible. Los datos generados se analizaron utilizando FlowJoTM versión 10.8.1 (Becton Dickinson & Company 2006-2021).

La actividad de nucleación del hielo y la tolerancia a la congelación en L. gaiensis se investigaron mediante un ensayo de congelación de gotas69 en VR66-07 y R86-47, y en VR66-10 y R86-45, dos cepas recolectadas de los mismos lagos1. Antes de los análisis, las cepas se cultivaron a 4 °C, 50 µmol de fotones.m-2.s-1, 12 h de oscuridad: 12 h de luz. Se cargaron de veinte a treinta y dos réplicas de 20 µl de cada una de las cuatro cepas en placas de 384 pocillos (VWR International, Lutterworth, Reino Unido). Cada placa también contenía de 20 a 32 réplicas de células INA Pseudomonas syringae R10.7970 suspendidas en MWC (control positivo) y 20 a 32 réplicas de MWC (control negativo). Utilizamos tratamientos de calor y filtrado siguiendo el protocolo descrito en la ref. 23 para evaluar la naturaleza de los compuestos de INA. Un subconjunto de cultivos se filtró sobre una membrana de policarbonato (jeringa Q-max, Frisenette) para aislar partículas de un tamaño inferior a 0,22 µm (es decir, fracción soluble). Se utilizó un paso de desnaturalización por choque térmico, de 10 min de incubación a 100 °C, para revelar si las partículas solubles y las partículas totales de INA (solubles y particuladas) tenían un origen proteico71. Se cargaron de veinte a treinta y dos réplicas de 20 µL de cada tratamiento junto con los controles. Los perfiles de congelación se determinaron utilizando dos réplicas biológicas para un total de 52-64 réplicas por tratamiento y por cepa (n = dos experimentos × 20–32 réplicas) y de 116 réplicas para cada control (n = dos experimentos × duplicado × 20– 32 réplicas), para cada una de las temperaturas investigadas. Las placas se incubaron durante 30 minutos en una cámara climática ambiental (Binder MK115, Tuttingen, Alemania) a través de un gradiente de -4 a -21 °C, con un incremento de -1 °C. La concentración inicial de microalgas oscila entre 0,2 y 13,5 × 105 células.ml-1 (340-26.933 células por inoculado). La fracción de pocillos congelados por condición y cepas se controló visualmente a lo largo del gradiente de temperatura.

La fracción congelada (FF, es decir, proporción de réplicas congeladas para un tratamiento y una cepa determinados) se calculó utilizando la ecuación de la ref. 72. El FF del control negativo se restó al FF de cada muestra. El número de partículas nucleantes de hielo (INP) por réplica se calculó utilizando una ecuación modificada de Vali72, descrita en 23, teniendo en cuenta la concentración de microalgas por réplica. Los valores negativos y las mediciones con menos de tres apariciones consecutivas por encima del límite de detección se eliminaron de los conjuntos de datos de FF e INP. Los datos de INP proporcionados en la Fig. 6 se normalizaron con respecto a los controles negativos. Los análisis gráficos se realizaron utilizando el software R versión 4.2.073 y los paquetes ggplot274, scales versión 1.2.075, dplyr76 y grid77. Luego las placas investigadas se incubaron a 4 °C en condiciones que favorecieran el crecimiento. El crecimiento de cada inóculo se controló como se mencionó anteriormente durante un período de 23 días de incubación.

La presencia de epibiontes de microalgas se investigó mediante hibridación fluorescente in situ y contratinción fluorescente. Las células se fijaron mezclando una parte del crecimiento celular con tres partes de PFA al 4% frío e incubando durante 12 h o 24 h a 4 °C. Las muestras fijadas se centrifugaron a 14.000 xg durante 5 minutos a 4 °C y el sedimento se lavó en solución salina tampón fosfato (PBS) 1x tres veces. Las células se resuspendieron en una mezcla 1:1 de PBS:etanol al 96% y se almacenaron a -20 °C. Antes de la hibridación celular, las células se filtraron en un filtro de membrana de policarbonato (tamaño de poro de 0,2 µm). La hibridación celular se realizó utilizando la sonda EUB-MIX78,79 (0,5 ng de ADN.μL-1) y la sonda NON-EUB de control negativo80, ambas marcadas con el tinte fluorescente Atto-488 en formamida al 35% durante 2 h a 46 °C. Luego, las células se tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 1 µg.mL-1) y se montaron en medio Citifluor:Vecta Shield (4:1 v:v). Las imágenes microscópicas se realizaron utilizando un microscopio de fluorescencia con un aumento de 400x (Eclipse Ni, Nikon, Axiovert 200 M, Zeiss) y se analizaron utilizando el software de imágenes NIS-Elements (v.4.50, Nikon Instruments Inc., Melville, NY, EE. UU.).

Los análisis estadísticos se realizaron en R73. La comparación de medias se realizó mediante ANOVA unidireccional y bidireccional bajo el supuesto de varianzas homogéneas, probadas mediante las pruebas F y Levene, y una distribución normal de residuos, probada mediante la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Se utilizó la prueba de rango post-hoc de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey para comparaciones múltiples por pares con un nivel de confianza del 95%. Tras la desigualdad de varianzas, se utilizó la prueba no paramétrica de suma de rangos de Kruskal-Wallis para determinar si las diferencias entre grupos eran estadísticamente significativas, con un nivel alfa significativo del 5%. Luego se realizaron comparaciones múltiples post hoc por pares utilizando la prueba de Dunn y el paquete R FSA versión 0.9.381. La comparación de proporciones se realizó mediante la prueba Z con corrección de continuidad para tamaños de muestra pequeños.

La investigación incluyó a investigadores locales durante todo el proceso de investigación; su relevancia ha sido discutida entre coautores y colegas. Los colaboradores acordaron las funciones, responsabilidades y el plan de investigación antes de la investigación. La investigación no fue severamente restringida ni prohibida en el ámbito de los investigadores. La investigación se basó en cultivos de microalgas y no fue aprobada por la ética local ya que no implica trabajos con humanos, animales o sustancias peligrosas. La investigación se llevó a cabo con estándares más altos y de acuerdo con la Universidad de Aarhus y las regulaciones danesas. La investigación no resultó en estigmatización, incriminación, discriminación ni ningún otro riesgo personal para los participantes. La investigación no implicó riesgos importantes para la salud, la seguridad ni otros riesgos para los investigadores, y las medidas básicas de seguridad del laboratorio se llevaron a cabo de acuerdo con las regulaciones de la Universidad de Aarhus. En esta investigación no se produjeron materiales biológicos, artefactos culturales ni conocimientos tradicionales asociados. En las citas se consideraron investigaciones locales y regionales relevantes para nuestro estudio.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el archivo de datos complementarios y de los autores correspondientes previa solicitud razonable. Las cepas investigadas están disponibles en la Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Göttingen, Alemania (SAG 2636-2639).

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Los autores agradecen a Merete Bilde por brindar acceso al tanque y a las instalaciones de aerosolización, y por sus comentarios sobre el manuscrito. Los autores también agradecen a Kasper V Kristiensen y Anders Feilberg por su discusión constructiva y su acceso al PTR-ToF-MS. Los autores agradecen a las unidades de Microbiología y Biología Acuática del Departamento de Biología de la Universidad de Aarhus por el acceso a la cámara climática ambiental y a las instalaciones de laboratorio. Los autores agradecen a Corina Wieber por proporcionar una alícuota de Pseudomonas syringae y a Jesper Lundsgaard Wulff y Lars Borregaard Pedersen por su apoyo técnico. Esta investigación y ST fueron financiados por el Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie no. 754513 y la Fundación de Investigación de la Universidad de Aarhus. BR fue financiado por una beca de investigación de Villum Fonden (42128) y la Fundación Novo Nordisk (NNF19OC0056963).

Instituto de Estudios Avanzados de Aarhus, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Sylvie VM Tesson

Departamento de Biología, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

Sylvie VM Tesson y Marta Barbato

Departamento de Química, Universidad de Aarhus, Aarhus, Dinamarca

bernardette rosati

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SVMT contribuyó a la conceptualización, curación de datos, análisis formal, adquisición de fondos, investigación, metodología, administración de proyectos, recursos, visualización, redacción del borrador original, revisión y edición. MB contribuyó a la investigación, la metodología y la revisión y edición de la redacción. BR contribuyó a la conceptualización, análisis formal, investigación, metodología, visualización, revisión de redacción y edición.

Correspondencia a Sylvie VM Tesson o Bernadette Rosati.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Naveen Sharma, Sylwia Śliwińska-Wilczewska y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Tobías Goris y David Favero.

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Tesson, SVM, Barbato, M. & Rosati, B. Flujo de aerosolización, bioproductos y capacidades de dispersión en la microalga de agua dulce Limnomonas gaiensis (Chlorophyceae). Común Biol 6, 809 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05183-5

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Recibido: 27 de febrero de 2023

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05183-5

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