Función de estabilización enzimática y termotolerancia de las proteínas LEA2 intrínsecamente desordenadas de la palma datilera

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11878 (2023) Citar este artículo

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En la palmera datilera, los genes LEA2 abundan, con sesenta y dos miembros que son casi todos ubicuos. Sin embargo, sus funciones e interacciones con posibles moléculas diana están en gran medida inexploradas. En este estudio, se clonaron, secuenciaron cinco genes LEA2 de palmera datilera, PdLEA2.2, PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7, y tres de ellos, PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2. .4 se caracterizaron funcionalmente por sus efectos sobre la termoestabilidad de dos enzimas distintas, la lactato deshidrogenasa (LDH) y la β-glucosidasa (bglG) in vitro. En general, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 fueron moderadamente hidrófilos, PdLEA2.7 fue ligeramente hidrófobo y PdLEA2.2 y PdLEA2.6 no fueron ninguno de los dos. La predicción de secuencia y estructura indicó la presencia de un tramo de residuos hidrofóbicos cerca del extremo N que potencialmente podría formar una hélice transmembrana en PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7. Además de la hélice transmembrana, la predicción de estructuras secundarias y terciarias mostró la presencia de una región desordenada seguida de una región de hoja β apilada en todas las proteínas PdLEA2. Además, se produjeron in vitro tres proteínas PdLEA2 recombinantes purificadas y su presencia en la reacción enzimática de LDH mejoró la actividad y redujo la formación de agregados de LDH bajo estrés térmico. En los ensayos enzimáticos de bglG, las proteínas PdLEA2 mostraron además su capacidad para preservar y estabilizar la actividad enzimática de bglG.

Las plantas han desarrollado vías reguladoras complejas para contrarrestar los efectos de las condiciones climáticas adversas. Los mecanismos para mejorar la tolerancia al estrés abiótico dependen en gran medida de moléculas de proteínas que funcionan y regulan directamente diversos procesos fisiológicos y vías de señalización de las plantas. La familia de genes de proteínas abundantes en embriogénesis tardía (LEA) es un grupo de proteínas funcionales que protegen y reducen los daños a las células vegetales en condiciones de estrés abiótico1. Estas proteínas tienen una estructura desordenada y se caracterizan por motivos repetidos2. Según los motivos de secuencia de aminoácidos conservados, las proteínas LEA se clasificaron en ocho grupos distintos, siendo las proteínas LEA2 el grupo más predominante en las plantas. Principalmente, las proteínas LEA2 se encontraron en grandes cantidades en semillas maduras de Gossypium hirsutum3 y se expresaron de manera ubicua en plantas con y sin flores4. Se acumulan principalmente en las últimas fases del desarrollo de las semillas y en los tejidos vegetativos para las respuestas de las plantas a las limitaciones ambientales5. Las proteínas LEA2 son inmensamente hidrófilas y se caracterizan como proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) que pueden variar su conformación en respuesta a los cambios en el microambiente ambiental6. Entre la subfamilia de proteínas LEA2, las dehidrinas (DHN) son un grupo bioquímico bien conocido que se compone principalmente de una alta proporción de aminoácidos cargados y polares, y una baja fracción de residuos hidrofóbicos y no polares7.

Las proteínas LEA2 están ampliamente involucradas en las respuestas fisiológicas de las plantas para mejorar la tolerancia al estrés abiótico. La sobreexpresión de Triticum aestivum L., TaLEA2-1 en trigo mejoró el crecimiento de las raíces y la altura de las plantas y condujo a una mayor actividad catalasa en comparación con las plántulas de tipo silvestre. TaLEA2-1 confirió una tolerancia mejorada a la salinidad en plantas de trigo transgénico TaLEA2-15. Además, en un estudio reciente, se descubrió que el gen LEA2, PtrDHN-3, de Populus trichocarpa desempeña un papel esencial en la tolerancia al estrés por sal y sequía8. Se observó que la sobreexpresión de PtrDHN-3 aumentó la tolerancia a la sal de la levadura transgénica y mejoró la tasa de germinación, el peso fresco y el contenido de clorofila de las plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana sometidas a estrés salino8. Además, las plantas de Arabidopsis transformadas con genes LEA2 de algodón mostraron un mayor crecimiento bajo estrés por sequía en comparación con el tipo salvaje9. Además, en el maíz se aisló un gen DHN tipo KS, ZmDHN13, y su sobreexpresión en plantas de tabaco transgénicas mejoró la tolerancia al estrés oxidativo10. En otro estudio, la sobreexpresión del gen LEA2 de Prunus mume en tabaco transformado y Escherichia coli mejoró la tolerancia al estrés por frío11. Además, la sobreexpresión de dos DRE de A. thaliana, AtDREB1A o AtDREB2A, dio como resultado una inducción de genes interconectados de estrés por frío de las proteínas LEA2, como rd29A y COR4712. En los supuestos promotores de los genes LEA2 del algodón americano (upland), G. hirsutum, se encontraron varios elementos cis relacionados con el estrés abiótico. Incluía elementos MYBCORE, ABRELATERD1, secuencia similar a ABRE y ACGTATERD1 que se sabe que tienen un papel funcional en el estrés abiótico13,14. La presencia de estos elementos promotores del estrés respalda firmemente el papel de las proteínas LEA2 en la mejora de la tolerancia al estrés abiótico en plantas que crecen en climas hostiles.

En la planta resucitada, Craterostigma plantagineum, se han identificado varias proteínas y transcripciones de ARNm de LEA durante un ciclo de estrés por desecación15. De manera similar, para obtener información sobre Phoenix dactylifera, una planta extremófila leñosa que prospera en condiciones ambientales adversas, se realizó un análisis de RNA-Seq para comprender la vía de señalización ABA de la palmera datilera en respuesta al estrés por sequía16. El pabellón auricular de la palmera datilera fue tratado con la hormona ABA que dio como resultado la expresión de 153 genes expresados ​​diferencialmente (DEG)16. Entre los genes destacados, se informó que los genes LEA estaban regulados positivamente junto con las fosfatasas de la familia PP2C, los transportadores del casete de unión de ATP (ABC) y el factor de transcripción de células protectoras MYB74. Además, se realizó una secuenciación del genoma completo de la palmera datilera y se encontraron genes LEA2 abundantemente presentes en el ensamblaje del genoma de la palmera datilera17. Se encontró que los genes LEA2 consistían en sesenta y dos variantes en la palmera datilera17. Además, se informó una alta expresión de los genes LEA2 en palmeras datileras inoculadas con Piriformospora indica bajo estrés de salinidad18. Estos hallazgos argumentan a favor de la participación de los genes LEA2 en los mecanismos de tolerancia al estrés abiótico de la palmera datilera.

Aunque se han realizado varios análisis moleculares y fisiológicos de genes relacionados con el estrés en P. dactylifera, la caracterización funcional de los genes LEA2 (PdLEA2) de P. dactylifera aún es oscura19. Sin embargo, se cree que las proteínas LEA2 son proteínas no estructuradas altamente flexibles que pueden funcionar como chaperonas e interactuar con varias moléculas asociadas, como proteínas, membranas, ácidos nucleicos e iones metálicos20. Un estudio reciente anotó las propiedades funcionales de las proteínas LEA2, que incluyeron sus funciones en la protección de membranas, la estabilización de macromoléculas, el apoyo a la eliminación de radicales libres y la actuación como antioxidantes para aliviar los daños oxidativos causados ​​a las plantas en condiciones de estrés abiótico6. Al igual que las proteínas LEA2, las principales proteínas de choque térmico (hsp) tienen algún tipo de función relacionada en la solución del problema del plegamiento incorrecto y la agregación, así como su función como acompañantes. Por lo tanto, las proteínas LEA2 desempeñan funciones cruciales en la protección de otras moléculas de proteínas y enzimas de la agregación y estabilizan sus actividades en varias condiciones de tratamiento hostiles. Sin embargo, se han desarrollado pocos ensayos enzimáticos funcionales para examinar el papel protector de las proteínas LEA2 sobre las actividades enzimáticas. Además, se observa que la mayoría de las enzimas industriales se degradan debido a la temperatura extrema en las condiciones de procesamiento, durante las cuales es necesario conservar la enzima.

Basándose en las propiedades funcionales de las proteínas LEA2, pueden utilizarse para la estabilización y preservación de actividades enzimáticas del calor durante procesos industriales durante un período más prolongado. En relación con esto, es necesario investigar el papel de las proteínas LEA2 en la preservación de la termosensibilidad de las enzimas lactato deshidrogenasa (LDH) y β-glucosidasa (bglG). La enzima LDH actúa como cofactor redox al utilizar el par NADH/NAD+ para catalizar la interconversión de piruvato (oxoácido) y lactato (alfa-hidroxiácido)21. Se utiliza para la conversión de piruvato vegetal en ácido láctico en condiciones anaeróbicas. Mientras que bglG es una enzima celulolítica que se emplea en la degradación de la biomasa celulósica. Participa en la hidrólisis de carbohidratos como el almidón, el glucógeno y sus derivados disacáridos en sus monómeros22. Ambas enzimas se utilizan a gran escala para aplicaciones industriales y biotecnológicas.

Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue examinar y caracterizar el papel de las proteínas LEA2 de P. dactylifera en la termotolerancia de las enzimas. El presente estudio enfatizó las similitudes y diferencias entre las cinco proteínas PdLEA2 en términos de sus características fisicoquímicas, constituyentes de aminoácidos, propensión a desordenes, motivos estructurales preservados y predijo su estructura secundaria y terciaria. Además, se produjeron proteínas recombinantes PdLEA2 y se aclaró su papel protector sobre las actividades y estabilidades enzimáticas de LDH y bglG en condiciones de estrés por calor. Los hallazgos del presente estudio serán el primer avance para identificar la propiedad chaperona de las proteínas LEA2 de la palma datilera en la interacción proteína-enzima. Construirá una vía para la identificación de los socios integrales de las proteínas LEA2 y los componentes objetivo en la célula, proporcionando una percepción ampliada de su fenómeno protector para la tolerancia al estrés de los cultivos.

Los genes PdLEA2 se asignaron a diferentes cromosomas en la palmera datilera. Según una búsqueda BLAST en el conjunto del genoma de la palmera datilera Barhee BC4 (GCF_009389715.1), PdLEA2.2 no se asignó a ningún cromosoma, mientras que PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7 se distribuyeron en los cromosomas 7, 14, 3 y 2, respectivamente. Las secuencias de ARNm se depositaron en NCBI GenBank y las muestras de ARNm y proteínas se proporcionan en la Tabla S1.

Los pesos moleculares predichos de las proteínas PdLEA2 oscilaron entre 22,04 y 35,43 kDa, teniendo PdLEA2.3 el peso molecular más alto de 35,43 kDa, con 317 aminoácidos, y PdLEA2.6 teniendo el peso molecular más bajo de 22,04 kDa, con 202 aminoácidos (Tabla 1). El análisis de las propiedades fisicoquímicas reveló que la mayoría de las proteínas PdLEA2 aisladas tenían puntos isoeléctricos relativamente altos (pI > 7) (Tabla 1), lo que indica que las proteínas PdLEA2 eran en su mayoría básicas. El índice GRAVY calculado (Tabla 1), una indicación de la hidrofobicidad promedio de la proteína, mostró que PdLEA2.7 era ligeramente hidrofóbico (> 0), PdLEA2.3 y PdLEA2.4 eran moderadamente hidrofílicos (< 0) y PdLEA2. 2 y PdLEA2.6 tuvieron una puntuación cercana a 0. Sin embargo, ampliando esto al nivel de residuos, los gráficos de Kyte-Doolittle (Fig. 1A) indicaron la existencia de tramos de regiones de alta hidrofobicidad cerca del extremo N de PdLEA2.2. PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7. PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7 se clasificaron como proteínas inestables con un índice de inestabilidad de 49,27, 43,09, 41,89 y 41,83, respectivamente. Mientras que PdLEA2.3 se mantuvo bastante estable con un índice de inestabilidad de 21,6. El índice alifático de las cinco proteínas PdLEA2 fue alto y osciló entre 84,4 y 105,5, lo que indicó que las proteínas PdLEA2 son termoestables en un amplio rango de temperaturas.

Características estructurales de las proteínas PdLEA2 y su hidropatía. (A) Gráficos de hidropatía de Kyte-Doolittle de proteínas PdLEA (ProtScale, ExPASy). Las proteínas PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 muestran gráficos de hidropatía casi idénticos con ciertas variaciones en los terminales N y C, en contraste con PdLEA2.6 y PdLEA2.7 que poseen gráficos de hidropatía similares. La propensión a los trastornos de las proteínas PdLEA2 evaluadas con DISPORED se muestra en color verde. Se utilizó el límite predeterminado de 0,5 para definir regiones desordenadas. (B) Predicción de la estructura secundaria de las proteínas PdLEA2 utilizando PSIPRED. La región de hélice α prevista es de color rosa, la hebra β de amarillo y la bobina aleatoria de gris. Las regiones desordenadas predichas por DISOPRED están marcadas con rectángulos negros. (C) Modelo estructural tridimensional de PdLEA2 desarrollado con AlphaFold2. Las proteínas se muestran en representación de dibujos animados y se colorean según la puntuación de pLDDT, donde azul: pLDDT > 90; cian: 70 < pLDDT < 90; amarillo: 50 < pLDDT < 90; naranja: pLDDT < 50. Los extremos N y C de las proteínas y la región transmembrana (TM) predicha por MEMSTAT están marcados.

Se identificó una gran similitud en la estructura secundaria y la propensión al desorden de las cinco proteínas PdLEA2. La predicción de la estructura secundaria de la composición de la secuencia de PdLEA2 se realizó utilizando PSIPRED (Fig. 1B; Tabla 2). Evidentemente, la estructura secundaria plegada más predominante es la cadena β, 38-49%, predicha con el mayor nivel de confianza. Estuvieron presentes bobinas aleatorias y distribuidas a lo largo de toda la secuencia. Sin embargo, se predijo un largo tramo de región enrollada en la región N-terminal de todas las proteínas PdLEA2, lo que aumentó la composición total de este estado y osciló entre el 31 y el 45% de las estructuras.

Como se sabe que las proteínas LEA2 albergan regiones intrínsecamente desordenadas, la propensión al desorden de PdLEA2 se predijo utilizando DISOPRED. En todas las secuencias de PdLEA2, se identificó una región desordenada de longitud variable en la región N-terminal de la proteína (Fig. 1A). Además, también se identificó una región desordenada cerca de la región C-terminal de PdLEA2.3, PdLEA2.4 y PdLEA2.7. Las regiones desordenadas correspondientes a las proteínas PdLEA2 están encerradas en rectángulos negros en la Fig. 1B.

Las estructuras 3D de las proteínas PdLEA2 se modelaron utilizando AlphaFold2, un sistema de predicción de estructuras de proteínas basado en inteligencia artificial. Las estructuras predichas de las cinco proteínas se muestran en la Fig. 1C. Como se desprende de las figuras, en todas las proteínas, la región N-terminal tenía una región desordenada distinta para la cual no se podía predecir una estructura 3D. Esto se indica por el bajo valor del valor de la prueba de diferencia de distancia local predicha (pLDDT), un indicador de la confianza del nivel de residuos en la estructura predicha, en esta región. En general, estructuralmente las cinco proteínas PdLEA2 parecen tener una arquitectura conservada que consiste en una región N-terminal desordenada, seguida de una hélice α y una estructura terciaria que consta de dos láminas β apiladas. En particular, la estructura de la hoja β apilada está duplicada en el caso de PdLEA2.3.

Se predijo una región superpuesta con alta hidrofobicidad (Fig. 1B) y helicidad (Fig. 1A) en cada una de las proteínas PdLEA2 después de la región desordenada predicha (Fig. 1B). Por lo tanto, para evaluar si las proteínas PdLEA2 podrían localizarse en la membrana, se utilizaron múltiples herramientas de predicción de dominios transmembrana (MEMSTAT, DeepTMHMM y TOPCONS) para predecir regiones transmembrana en PdLEA2 (Tabla 2). Curiosamente, todos estos predictores indicaron que la hélice hidrofóbica identificada anteriormente es potencialmente una hélice α transmembrana. La única discrepancia parece estar en PdLEA2.3, donde no hubo consenso entre los resultados de los tres predictores. Además, los predictores sugirieron que la región N-terminal desordenada de las proteínas PdLEA2 es intracelular, mientras que la región rica en cadena β reside fuera de la célula.

Los dominios conservados en las secuencias de PdLEA2 se identificaron mediante CD-Search contra la base de datos de dominios conservados (CDD) del NCBI. Se descubrió que las proteínas PdLEA2.2, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7 albergan un dominio conservado completo de la superfamilia LEA_2. Mientras tanto, se observó que PdLEA2.3 tiene dos dominios de estrés hídrico y respuesta hipersensible (WHy), que también es miembro de la superfamilia LEA_2 (Tabla 3). Todos los dominios conservados identificados (pfam03168 y smart00769) son miembros de la superfamilia cl12118 LEA_2. Además, MEME identificó la presencia de 4 motivos conservados estadísticamente significativos dentro de las secuencias de PdLEA2 (Tabla 4). Sin embargo, las cinco secuencias solo compartieron un motivo conservado con una secuencia consenso de DVLIRNPN.

La alineación global de secuencias múltiples de las secuencias de la proteína PdLEA2 produjo una identidad de secuencia baja que oscila entre 8,28 y 26,41%, lo que indica una conservación general deficiente de la secuencia característica de la superfamilia LEA2. Sin embargo, estas diferencias de secuencia no le impiden producir un pliegue tridimensional similar al comentado anteriormente. Una búsqueda de todas las secuencias de proteínas de la palmera datilera en la base de datos de proteínas NCBI RefSeq, que alberga un miembro de la secuencia de la superfamilia LEA, mostró que la mayoría de estas secuencias no han sido bien caracterizadas ni anotadas adecuadamente. No hace falta, se generó un árbol filogenético utilizando secuencias de PdLEA2 (Fig. S1). Se identificó que PdLEA2.2 está cerca de la proteína 6 similar a NDR1/HIN1, PdLEA2.3 cerca de la proteína Lea14-A, PdLEA2.4 cerca de la proteína 10 similar a NDR1/HIN1 y PdLEA2.7 cerca de NDR1/HIN1- como la proteína 1, mientras que PdLEA2.6 se ubicó en proteínas anotadas como no caracterizadas.

Para la PCR en tiempo real se utilizaron muestras de ARN de raíces y hojas de dos genotipos contrastantes cultivados bajo control y condiciones de estrés salino. Ya sea en la variedad de palmera datilera sensible a la sal, Khalas, o en la variedad de palmera datilera tolerante, Lulu, la expresión de los genes PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 bajo estrés salino mostró un aumento significativo (p < 0,05). tanto en raíces como en hojas, en comparación con las plantas de control no estresadas (Fig. 2A-B). Sin embargo, en raíces bajo control o condiciones de estrés por salinidad, la expresión de los genes PdLEA2 no mostró diferencias significativas entre las variedades tolerantes y sensibles (Fig. 2A). Por el contrario, en hojas sometidas a estrés por salinidad, se observó una diferencia significativa entre el nivel de expresión de los genes PdLEA2 entre las variedades tolerantes y sensibles, pero no bajo la condición de control (Fig. 2B). El nivel de expresión de los genes PdLEA2 fue mayor en hojas que en raíces para ambos genotipos.

Perfil de expresión de genes PdLEA2 de los cultivares Lulu y Khalas bajo estrés salino. (A) Raíces (B) Hojas. Los datos del nivel de expresión son las medias ± DE (n = 3) de las raíces y hojas, analizadas con ANOVA unidireccional y prueba HSD de Tukey. Letras diferentes indican una diferencia significativa en los niveles de expresión (p < 0,05).

Los ORF PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 se clonaron en marco con la etiqueta de polihistidina del vector de expresión pET28a. Las proteínas PdLEA2 recombinantes se expresaron en células de E. coli (cepa BL21) y se evaluaron mediante SDS-PAGE. Después de la inducción con IPTG, las proteínas PdLEA2 se acumularon en grandes cantidades en las células de E. coli (Fig. 3A; Fig. S2). La cromatografía de afinidad con columna de níquel se utilizó para purificar las proteínas PdLEA2 sobreexpresadas. La pureza de las proteínas PdLEA2 se verificó mediante análisis de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-His6 (Fig. 3B; Fig. S2). Como era de esperar, la inmunotransferencia reveló una banda para las proteínas PdLEA2, pero no con el control.

Análisis SDS-PAGE y Western blot de la expresión y purificación de proteínas PdLEA2. (A) Perfil SDS-PAGE de proteínas recombinantes, el carril 1 es la escalera de proteínas, los carriles 2, 3 y 4 son muestras inducidas de PdLEA2.4, PdLEA2.3 y PdLEA2.2, y el carril 5 es el control. (B) Transferencia Western de las proteínas 1-Control, 2-PdLEA2.4, 3-PdLEA2.3 y 4-PdLEA2.2, identificadas mediante un anticuerpo específico de la etiqueta His6.

Se probó la capacidad de PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 para inhibir la pérdida de actividad de LDH después del estrés por calor. Los efectos de las proteínas PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 se compararon con BSA, un protector no específico, y con la enzima LDH tratada con tampón sin agregar proteína (Fig. 4A-C). Después de 10 minutos de estrés por calor, en proporciones de masa de 1:1, 1:20 y 1:40, se observó una diferencia significativa (p < 0,001) en la estabilización de la enzima LDH con las proteínas PdLEA2, en comparación con BSA y tampón sin proteína adicional. Se encontró que las proteínas PdLEA2 proporcionaban un mayor escudo a la LDH que la BSA y el tampón, observándose la mayor protección para PdLEA2.2, 90% en 1:1 y 115% en 1:40 dentro de los 10 minutos posteriores al estrés por calor (Fig. .4A). Se observó que la mitad de la actividad de la enzima LDH se perdió con el tampón después de 10 minutos de calentamiento a 50 °C. De manera similar, después de 20 minutos de estrés por calor, también hubo una diferencia significativa (p <0,001) entre la actividad enzimática LDH con proteínas PdLEA2, en comparación con BSA, y el tampón sin adición de proteínas en las tres proporciones de masa (Fig. 4B). . El porcentaje de recuperación de la actividad enzimática fue el más alto para la proteína PdLEA2.2, que aumentó con el aumento de la proporción de masa de proteínas, 65 % (1:1) y 115 % (1:40). Además, se observó una diferencia significativa (p <0,001) dentro de los 30 minutos de la actividad enzimática bajo estrés por calor (Fig. 4C) entre la actividad de recuperación de las proteínas PdLEA2, BSA y el tampón sin proteínas en una proporción de masa de 1:1 y 1:20. Sin embargo, en una proporción de masa de 1:40 y después de 30 minutos de estrés por calor, hubo una diferencia significativa (p <0,001) entre las proteínas PdLEA2 y el tampón sin proteínas, pero no se observó una diferencia significativa entre la estabilización proporcionada por el PdLEA2. proteínas y BSA. En la proporción de masa más alta (1:40) y después de 30 minutos a 50 °C, PdLEA2.2 protegió al menos el 90 % de la actividad enzimática, mientras que PdLEA2.3 y PdLEA2.4 conservaron el 86 % y el 84 % de la actividad enzimática. , respectivamente. Mientras que la recuperación de la actividad enzimática se redujo al 80% para el BSA y al 20% para el tampón sin proteína. Esto indicó que las proteínas LEA2 proporcionaron la estabilización de la actividad enzimática sin efectos de la presencia de una segunda proteína no específica en las diferentes proporciones de masa con tiempos de incubación más largos. Así, se observó que la actividad enzimática de la LDH estaba completamente protegida después de 10 min, 20 min o 30 min de condición de estrés por calor con la presencia de proteínas PdLEA2 en proporciones de masa de 1:1, 1:20 y 1:40. .

PdLEA2 protege la LDH contra la inactivación y previene su agregación bajo estrés térmico en contraste con BSA y buffer. Recuperación de la actividad de la enzima LDH durante el calentamiento a 50 °C durante (A) 10 min (B) 20 min y (C) 30 min. Los datos se expresan como medias ± DE (n = 3), analizados mediante ANOVA unidireccional. Letras diferentes indican una diferencia significativa (p < 0,05) evaluada mediante la prueba HSD de Tukey.

La enzima LDH forma agregados cuando se expone a tratamientos de deshidratación, calentamiento o congelación-descongelación. Este estudio examinó la capacidad de las proteínas PdLEA2 para disminuir la agregación de la enzima LDH en condiciones de estrés por calor midiendo la absorbancia aparente de dispersión de luz de las soluciones de proteínas. El impacto de las proteínas PdLEA2 sobre las enzimas se estudió en dos proporciones de masa de 1:1 y 1:2. Se observó que la LDH formó una agregación masiva después de calentar a 80 °C durante 20 min. En ambas proporciones de masa, hubo una diferencia significativa (p <0,001) en la inhibición de la formación de agregados de LDH bajo estrés térmico con la adición de proteínas PdLEA2 y BSA (Fig. 5). La existencia de las proteínas PdLEA2 disminuyó la agregación enzimática de LDH en ambas proporciones de masa en contraste con la BSA (Fig. 5). Para el ensayo enzimático bajo estrés térmico, la absorbancia en presencia de PdLEA2 se redujo más de la mitad de la formación de agregados en presencia de BSA en ambas proporciones de masa (Fig. 5). Se descubrió que la agregación de LDH era consistentemente menor a una tasa de actividad similar entre las tres proteínas PdLEA2.

Actividad antiagregación de LDH de PdLEA2 bajo estrés por calentamiento. La agregación enzimática se controló en un espectrofotómetro a una tasa de absorbancia de 340 nm. Se agregaron proteínas PdLEA2 y BSA a la reacción enzimática de LDH en dos proporciones de masa diferentes. Los datos son las medias ± DE (n = 3), con letras diferentes que indican una diferencia significativa (p < 0,05) analizadas mediante la prueba HSD de Tukey después de ANOVA unidireccional.

Para probar el efecto protector de las proteínas PdLEA2 sobre la actividad enzimática bglG a 70 °C, se agregaron proteínas recombinantes PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 (0,5 µg ml-1) a la reacción de la enzima bglG. Los tratamientos se realizaron con y sin proteínas PdLEA2 durante intervalos de tiempo de 15 min hasta 90 min. Se observó una diferencia significativa (p <0,001) en la actividad enzimática con y sin proteínas PdLEA2 en los diferentes intervalos de tiempo de la reacción de estrés por calor (Fig. 6). La actividad de la enzima bglG disminuyó drásticamente en ausencia de las proteínas PdLEA2 en 30 minutos hasta un 22 %, mientras que se encontró que la proteína PdLEA2.2 conservaba el 90 % de la actividad enzimática en el mismo intervalo de tiempo. Por el contrario, las proteínas PdLEA2.3 y PdLEA2.4 conservaron el 71% y el 55% de la actividad enzimática después de 30 minutos de estrés por calor, respectivamente. Además, después de 60 minutos de incubación, el 65% de la actividad relativa de la enzima fue estabilizada por PdLEA2.2, el 46% y el 33% por PdLEA2.3 y PdLEA2.4. Mientras que disminuyó al 15% sin las proteínas PdLEA2 a los 60 minutos de estrés por calor. Después de 90 minutos de estrés por calor, se observó que la actividad de la enzima bglG se redujo al 5% en ausencia de las proteínas PdLEA2, y en presencia de PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4, la actividad de la enzima bglG disminuyó. se mantuvo en 33%, 20% y 10%, respectivamente. Este hallazgo indica que las proteínas PdLEA2 tienen un efecto conservante sobre bglG bajo estrés por calentamiento, proporcionando una actividad mejorada de la enzima a temperaturas más altas en contraste con el uso de bglG solo.

Efecto de las proteínas PdLEA2 sobre la termoestabilidad enzimática bglG. La enzima bglG se incubó con y sin proteínas PdLEA2 a 70 °C durante el cual la enzima pierde su actividad catalítica. La actividad relativa se determinó tomando alícuotas en diferentes intervalos de tiempo. Los datos son las medias ± DE (n = 3).

En las plantas, las proteínas LEA2 se han caracterizado funcionalmente y están involucradas en las respuestas al estrés ambiental de varias plantas, específicamente plantas tolerantes a la sequía23, halófitas24, plantas de resurrección15 y plantas tolerantes al frío25. En este estudio, se identificaron, caracterizaron y exploraron por primera vez las proteínas LEA2 de P. dactylifera por su posible implicación en la estabilidad enzimática y la termotolerancia.

Los genes LEA2 están abundantemente presentes en el conjunto del genoma de P. dactylifera y tienen sesenta y dos miembros, en comparación con cincuenta y dos y cuarenta y seis en el arroz y el sorgo, respectivamente17. Además, había treinta genes LEA2 en Prunus salicina26, veintisiete en Solanum lycopersicum27, cincuenta y tres en populus28, veintinueve en Solanum tuberosum29 y treinta y dos en la planta del té4. Por el contrario, el número de genes LEA2 fue mucho mayor en Ramonda serbica20 y Arachis hipogaea30, que tenían 127 y 78 miembros, respectivamente. La abundancia de genes LEA2 en la palmera datilera puede describirse como los últimos miembros en evolucionar entre el grupo de genes LEA o debido a todo el evento de duplicación de genes dentro de este grupo como ocurrió en las plantas de algodón9. La gran abundancia o redundancia de un grupo de genes particular indica el papel principal que desempeña en la mejora de la supervivencia de las plantas. La palmera datilera que crece en las regiones áridas enfrenta continuamente duras condiciones ambientales. Su crecimiento bajo el estrés ambiental se puede atribuir a la acumulación de diversos genes LEA2 tolerantes al estrés o debido a la integración de estos genes con varios otros mecanismos reguladores de genes para activar respuestas adaptativas.

La ubicación de un gen en el cromosoma juega un papel esencial en la configuración del rasgo de un organismo y su evolución. Los genes PdLEA2 estaban ampliamente distribuidos y ubicados en diferentes cromosomas del genoma de la palmera datilera. El rango de secuencia de aminoácidos de las proteínas PdLEA2 identificadas estaba entre 202 y 317 aa, que es mayor que el encontrado en los frijoles de laurel 31 y las plantas de té 32, pero está en un rango cercano a los DHN de Rhododendron catawbiense, RcDhn 1–533. Sin embargo, el peso molecular de las proteínas PdLEA2 era menor que el de A. thaliana34 y el algodón9, que se extendían entre 67,2 y 160,7 kDa, respectivamente. Los valores de pI de las proteínas PdLEA2 oscilaron entre 4,85 y 9,96, lo que indica que las proteínas PdLEA2 aisladas eran de naturaleza básica, similares a las proteínas LEA2 de Brachypodium distachyon35 y a las proteínas LEA de trigo36. El pI promedio de las proteínas PdLEA2 mostró una mayor asociación con los grupos LEA de G. hirsutum, específicamente DHN y SMP9.

En términos de hidrofobicidad, los valores de GRAVY indicaron que dos de las proteínas, PdLEA2.3 y PdLEA2.4, eran moderadamente hidrofílicas, mientras que PdLEA2.7 era hidrofóbica y PdLEA2.2 y PdLEA2.6 estaban en el medio. En particular, los gráficos de Kyte-Doolittle indicaron la presencia de un largo tramo de región hidrofóbica que se predijo que formaría una hélice transmembrana. La naturaleza hidrofílica moderada de las proteínas PdLEA2.3 y PdLEA2.4 puede permitirles formar un enlace de hidrógeno con moléculas de agua y, por lo tanto, disolverse en agua, lo cual es una interacción termodinámicamente favorecida. La propiedad hidrofílica se observó previamente en las proteínas LEA2 de otras plantas37. Les permite desordenarse total o parcialmente, una característica única de las proteínas LEA. La propiedad hidrófila es además necesaria para formar elementos estructurales flexibles, como chaperonas moleculares, que son esenciales para la protección de la planta contra la desecación38. Por otro lado, la naturaleza hidrofóbica de las proteínas PdLEA2.7 les permite plegarse espontáneamente en estructuras complejas y permitir además la descarga de aminoácidos no polares de los disolventes. Este atributo ocurre comúnmente en las proteínas de los canales de agua, como las acuaporinas (AQP), que son altamente hidrofóbicas y desempeñan un papel importante en la tolerancia de las plantas al estrés por sequía y salinidad39. El índice de inestabilidad mostró que la mayoría de las proteínas PdLEA2 aisladas eran inestables en contraste con las LEA de Sorghum bicolor, SbLEA y S. lycopersicum, SiLEA que eran similares a la proteína PdLEA2.3 estable27,40. Las proteínas PdLEA2 mostraron un índice alifático alto, lo que sugiere que su volumen relativo está ocupado en gran medida por cadenas laterales alifáticas como alanina, isoleucina, leucina y valina, que mejoran su termoestabilidad. Las proteínas LEA no son proteínas transmembrana ya que pueden ubicarse en el núcleo, cloroplasto, mitocondrias y citoplasma41. Por el contrario, las proteínas PdLEA2 exhibieron hélices transmembrana, lo que indica su expresión en compartimentos subcelulares. La presencia de al menos una hélice α transmembrana se identificó de manera similar en las proteínas LEA2 de R. serbica20.

El análisis del dominio conservado de las proteínas PdLEA2 reveló la presencia de un dominio de la superfamilia LEA_2, pfam03168, en PdLEA2.2, PdLEA2.4 y PdLEA2.7. Estas proteínas que contienen el dominio LEA_2 se han correlacionado con varias respuestas de tolerancia de las plantas contra varios estreses abióticos como el calor, la sequía, la salinidad, el estrés osmótico, el daño de los rayos UV y el estrés oxidativo42,43,44,45. Además, PdLEA2.3 constaba del dominio WHy y la superfamilia LEA_2, smart00769. La presencia de la secuencia del dominio WHy se ha encontrado como ORF en ciertos genomas bacterianos del filo Firmicutes46. Se ha informado que la proteína bacteriana recombinante WHy exhibió un fenotipo de tolerancia al estrés en E. coli y proporcionó protección contra la desnaturalización de proteínas in vitro46. La desnaturalización de proteínas implica el daño de la estructura terciaria, resultando en la pérdida de estabilidad y estructura de la proteína. Además, PdLEA2.4 y PdLEA2.6 tenían el dominio de la superfamilia LEA_2, cl12118, que también se identificó en las proteínas LEA2 del algodón.

La mayoría de las proteínas LEA2 tienen motivos típicos que son esenciales para su identificación. En las proteínas PdLEA2, se encontró que estaban presentes cuatro motivos distintivos. La longitud del motivo varió entre 8 y 24 aminoácidos. El motivo 2 estaba presente en todas las proteínas PdLEA2, mientras que el motivo 1 estaba presente en las proteínas PdLEA2.2 y PdLEA2.4 únicamente. De manera similar, en PdLEA2.2, PdLEA2.4 y PdLEA2.6 solo estaba presente el motivo 3 conservado. Además, el motivo 4 se encontró en PdLEA2.2, PdLEA2.4 y PdLEA2.7. La presencia de una composición de motivo común indica una especificidad funcional idéntica dentro del subgrupo de proteínas PdLEA2 identificada en S. tuberosum47. Anteriormente se informaron resultados idénticos de motivos conservados específicos del grupo de proteínas LEA para Arabidopsis34, S. lycopersicum27, Prunus26, álamo28, maíz48, Brassica49 y algodón9.

Se predice que las proteínas LEA2 serán desplazados internos6. El análisis estructural secundario y tridimensional de las cinco proteínas PdLEA2 mostró una región desordenada en el sitio N-terminal. Esta región fue seguida por una hélice α y una estructura terciaria que consta de tres horquillas β y hebras β. Por lo tanto, la estructura secundaria plegada más predominante fue la cadena β, con espirales aleatorias distribuidas a lo largo de las secuencias de la proteína PdLEA2. La estructura de las proteínas PdLEA2 fue similar a la predicción de la estructura secundaria en las proteínas LEA de frijol y R. serbica en relación con el contenido de lámina β, hélice α y espiral aleatoria31. Sin embargo, esto está en contradicción con las proteínas LEA del trigo que tenían hebras de lámina β más bajas36.

Debido a la ausencia de validación y buena anotación para las proteínas LEA2, el árbol filogenético generado utilizando secuencias de proteínas de palmera datilera que albergan miembros de la superfamilia LEA2 mostró que, en la mayoría de los casos, las proteínas PdLEA2 estaban ubicadas junto a proteínas anotadas como NDR1/HIN1 en el genoma de la palmera datilera. Los grupos de genes similares a NDR1/HIN1 (NHL) incluyen el gen 1 inducido por Harpin (HIN1) y el gen 1 de resistencia a enfermedades no específicas de raza (NDR1)50. HIN1 se acumula mediante una proteína harpin que participa en diferentes respuestas de defensa de las plantas al estrés abiótico50. Mientras que la clonación del gen NDR1 de A. thaliana indicó su función de respuesta a la resistencia a las enfermedades de las plantas51.

Los genes LEA2 se expresan en gran medida en respuesta al estrés abiótico en las plantas6. En este estudio, los genes PdLEA2 mostraron una expresión relativamente mayor en hojas de las variedades tolerantes y sensibles, plántulas de Lulu y khalas después de tratamientos de estrés por salinidad, respectivamente. Este hallazgo es consistente con la expresión de genes LEA en tejidos vegetativos de plantas de algodón, S. bicolor y maíz9,40,48. Las hojas son las principales partes de la planta que se ven afectadas por el estrés salino. La mayor acumulación de transcripciones de PdLEA2 en los tejidos de las hojas indica su papel en la preservación de la integridad estructural y la prevención del daño de la salinidad a las membranas. Además, las hojas son un sitio importante para la fotosíntesis, que se ve afectada debido a la liberación excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS) bajo estrés salino52. Las ROS son perjudiciales para el crecimiento de las plantas y la alta expresión de los genes PdLEA2 en las hojas, indica su participación en la eliminación de ROS a través de la mejora de las actividades de las enzimas antioxidantes, similar al gen LEA5 de Oryza sativa53.

La desnaturalización de proteínas es un fenómeno fisiológico frecuente que ocurre en las células vegetales ante estrés abiótico. Diferentes factores afectan las actividades enzimáticas como la temperatura, el pH, las concentraciones de sustrato y enzima, y ​​la presencia o ausencia de inhibidores y activadores en la reacción. Se ha informado de la estabilización térmica de la actividad enzimática como la glucosa oxidasa (GOD) en presencia de trehalosa, un soluto compatible más conocido que actúa como chaperona química54. En el presente estudio, se encontró que las proteínas PdLEA2 protegían las actividades enzimáticas LDH y bglG de los daños del estrés por calentamiento durante sus condiciones de reacción. La presencia de proteínas PdLEA2 permitió una mayor recuperación de las actividades enzimáticas LDH y bglG bajo estrés térmico, lo que indica que las proteínas PdLEA2 aisladas tienen una gran capacidad para proteger las enzimas. La protección enzimática de las proteínas LEA2 fue más eficaz que la proporcionada por BSA. Esto puede atribuirse a la estructura del trastorno, la hélice transmembrana y la región plegada que consiste en láminas β de proteínas PdLEA2 durante el estrés por calor o debido a su capacidad para actuar como chaperonas y unirse a membranas, iones metálicos y agua. La pérdida de actividad catalítica de LDH y bglG no solo se conservó, sino que las proteínas PdLEA2 impidieron aún más la agregación de la enzima LDH. Particularmente durante el secado, se ha encontrado una disminución en la agregación de otras proteínas LEA de plantas, lo que se asoció a la hipótesis del escudo molecular55. Varios estudios han indicado que las DHN pueden proteger las actividades de las enzimas LDH y bglG contra el daño causado por diversos tipos de estrés. En relación con las proteínas PdLEA2, se encontró que CdDHN4-L y CdDHN4-S recuperaron las actividades enzimáticas de LDH durante el daño por descongelación y el estrés por calentamiento56. Además, se informó que en presencia de Picea Wilsonii DHN, PicW1, la actividad de la enzima LDH fue mayor que la del control en blanco y BSA a 43 °C a 55 °C57. Alternativamente, las condiciones de estrés por calentamiento y congelación causan estrés hídrico y se descubre que ciertas DHN desempeñan el papel de agentes antiagregantes de otras moléculas de proteínas o enzimas bajo este estrés58. La función de las proteínas PdLEA2 en la protección de las actividades enzimáticas durante el estrés por calor fue similar a la de la proteína LEA3 del trigo, TdLEA355. De hecho, la adición de TdLEA3 en la proporción de masa más alta en la reacción conservó el 90% de la actividad enzimática de LDH a 48 °C después de 30 minutos. Los dominios estructurales de las proteínas LEA2 y el mecanismo que controla la protección de la actividad enzimática en condiciones de estrés se han investigado en pocos estudios como un mecanismo de protección térmica de las proteínas LEA2. En Brassica napus, las proteínas LEA3 protegieron a la LDH bajo estrés de desecación, lo que se atribuyó a su naturaleza hidrofílica, láminas β, hélice α y propensión a espirales aleatorias38. En el presente estudio, PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 eran moderadamente hidrófilos, tenían láminas β y propensión a espirales aleatorias, lo que puede haber contribuido a la protección de la enzima LDH bajo el estrés por calor. Además, en el ensayo de crioprotección, se produjo la formación de espirales aleatorias en Arabidopsis COR1559, lo que indicó el papel de la estructura de espirales aleatorias en la crioprotección de las enzimas. Se han realizado pocos estudios para investigar el papel de las proteínas LEA2 en la protección de la enzima bglG bajo estrés térmico. En nuestro estudio anterior, encontramos que la DHN-5 del trigo desempeñaba un papel relevante en la protección de la enzima bglG contra el estrés por calor60. El ensayo de truncamiento de DHN-5 indicó que los segmentos K eran vitales para la protección térmica de LDH y bglG61. Se observó que las formas truncadas de DHN-5 que contenían sólo uno o dos segmentos K eran capaces de proteger las actividades enzimáticas de LDH y bglG contra los daños causados ​​por diversos estreses in vitro, aunque en menor medida que la proteína de tipo salvaje. Además del impacto de los segmentos K en la mejora de la estabilidad térmica de LDH y bglG, estas formas truncadas replegaron adecuadamente las enzimas después del estrés térmico como la proteína de tipo salvaje. Sin embargo, las proteínas PdLEA2 carecen de segmento K y protegen la actividad de la enzima bglG, lo que indica un posible papel de la hidrofilicidad y la estructura de las láminas β en la protección de la enzima bglG bajo estrés térmico.

En este estudio, se caracterizaron las proteínas LEA2 de la palmera datilera y el análisis funcional aclaró su papel en la protección de las enzimas. Las proteínas PdLEA2 tenían una alta similitud de secuencia, hidrofilia y tenían una estructura desordenada. Se descubrió que las proteínas PdLEA2 aisladas de la palmera datilera protegían la estabilidad enzimática y la actividad de las enzimas LDH y bglG bajo estrés térmico. El papel protector de las proteínas PdLEA2 puede deberse a su estructura desordenada, hélice transmembrana y región plegada que consta de láminas β, lo que les permite estabilizar varias moléculas asociadas, como enzimas o proteínas diana, en diferentes compartimentos celulares durante el estrés por calor. La opulencia de los genes LEA2 en la palmera datilera y su caracterización funcional sienta una base importante para futuras investigaciones destinadas a comprender la relación evolutiva de la familia de genes LEA2 y su papel potencial en la tolerancia de las plantas a condiciones de estrés abiótico. Además, la generación de plantas transgénicas que sobreexpresen genes PdLEA2 brindará protección contra limitaciones ambientales como la salinidad, la sequía y el estrés por calor. Además, el uso de la fermentación para el crecimiento de células bacterianas en un gran volumen para mejorar la producción de proteínas PdLEA2 recombinantes se considera una aplicación potencial de este estudio. Los hallazgos actuales refuerzan la propuesta de que las proteínas PdLEA2 son moléculas vitales que pueden aprovecharse como chaperonas moleculares para desarrollar nuevas enzimas termorresistentes recombinantes con una velocidad de reacción y especificidad mejoradas.

Nuestra investigación experimental realizada en palmeras datileras cultivadas a partir de cultivos de tejidos se llevó a cabo de conformidad con todas las leyes agrícolas y de recursos genéticos aplicables para el manejo de plantas. Se obtuvo permiso para recolectar los materiales vegetales y se realizaron métodos experimentales de acuerdo con las directrices pertinentes.

Las plántulas de palmera datilera de los cultivares Lulu y Khalas cultivados en tejidos se cultivaron en medio líquido ½ MS y se mantuvieron en una cámara de crecimiento con una temperatura de 25 ± 2 °C, un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad a 280 μmol de fotones m-. 2 s−1, y con una humedad relativa del 70%. Para el tratamiento con sal, las plántulas recibieron NaCl 250 mM en el medio líquido ½ MS, mientras que las plántulas de control recibieron agua estéril. Las plántulas de P. dacrylifera se cultivaron en las mismas condiciones ambientales en la cámara de crecimiento durante dos semanas más. A partir de entonces, se recogieron las raíces del control y de las plantas tratadas con sal y luego se almacenaron a -80 °C para su análisis posterior.

Se utilizaron el genoma de P. dactylifera y los datos del transcriptoma de la raíz del cultivar Khalas para identificar las secuencias del gen LEA2. Todos los candidatos identificados se analizaron utilizando la base de datos Pfam (//pfam.sanger.ac.uk) para confirmar los dominios conservados. Se seleccionaron cinco genes PdLEA2 (PdLEA2.2, PdLEA2.3, PdLEA2.4, PdLEA2.6 y PdLEA2.7) y se diseñaron cebadores específicos para clonar los genes LEA2 respectivos (Tabla S2).

El ARN total se aisló de las raíces de las plántulas de control y estrés salino de P. dactylifera, variedad Khalas, siguiendo las instrucciones del fabricante utilizando el RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Alemania). Se utilizó el kit PrimeScript RT-PCR (TaKaRa Bio, Japón) para sintetizar el ADNc de la primera cadena a partir de los ARN aislados. Los ADNc sintetizados sirvieron como plantillas para la PCR con cebadores específicos diseñados con Primer Premier 6.0. La reacción de PCR se realizó durante 30 ciclos con una desnaturalización inicial de 3 min a 95 °C, seguida de una desnaturalización de 30 s para 95 °C, hibridación durante 30 s a 55 °C, extensión durante 1 min a 72 °C y con una extensión final de 7 min a 72 °C. Los productos de la PCR se separaron del gel de agarosa y se purificaron con columnas de centrifugación de GenElute menos bromuro de etidio (Sigma-Aldrich). Los productos purificados se clonaron en el vector pMiniT 2.0 utilizando el kit de clonación NEB PCR (Nueva Inglaterra, BioLabs, Inc.) y se secuenciaron mediante subcontratación con Macrogen TM (Corea del Sur) en ambas direcciones para verificar la secuencia de los genes LEA2.

Se aisló ARN total de hojas y raíces de plántulas de P. dactylifera control y estresadas por sal de dos variedades contrastantes, Khalas y Lulu, sensibles y tolerantes, respectivamente, utilizando el RNeasy® Plant Mini Kit (QIAGEN, Alemania). Se procesó un μg de ARN total de cada muestra con ADNasa I libre de ARNasa y se transcribió de forma inversa en ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de transcriptasa inversa SuperScript III de Invitrogen. Utilizando la máquina de PCR en tiempo real de Applied Biosystems, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real con SYBRTM Select Master Mix en placas de 96 pocillos (Applied Biosystems). Las PCR se realizaron en un volumen terminal de 10 µl que contenía 3 µl de ADNc (obtenido a partir de 40 ng de ARN tratado con ADNasa), 0,5 µl (a 10 µM) de cebadores, 5 µl de 2 × mezcla maestra SYBR Green I y 1 µl de agua libre de RNasa (Sigma). El proceso implicó una desnaturalización preliminar por 10 min a 94 °C, luego 45 ciclos con 94 °C por 10 s, 59 °C por 10 s, 72 °C por 15 s, seguido de una curva de licuación con 5 s a 95 °C. , 1 min a 65 °C y 5 min con temperatura aumentando de 65 °C a 97 °C. Se utilizó el software Primer3 Input para crear los cebadores para PCR en tiempo real que se muestran en la Tabla S3. Para calcular la relación nivel de expresión.

De los cinco genes LEA2 aislados de la palmera datilera, se seleccionaron tres para la expresión de proteínas en E. coli, en función de su índice de hidropatía (moderadamente hidrófilo). En consecuencia, el ORF completo de PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 (accesiones de GenBank: OQ348181, OQ348184, OQ348183) se amplificaron a partir del ADNc de Khalas de la palmera datilera con ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion (Nueva Inglaterra, Biolabs). , utilizando cebadores específicos con sitios de restricción agregados BamHI y EcoRI en los extremos 5' y 3' (Tabla S4). Los ORF PdLEA2.2, PdLEA2.3 y PdLEA2.4 se clonaron en los sitios BamHI y EcoRI del pET28a, vector de expresión de E. coli. La expresión de proteínas recombinantes de PdLEA2 en E. coli BL21 (DE3) se indujo a 37 °C con la adición de isopropiltio-β-galactósido (IPTG) 1 mM. El cultivo de células de E. coli se realizó durante 4 h adicionales, luego se recogieron y se lisaron con tampón NENT (NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, NP40 al 0,5%, Tris-HCl 20 mM y pH de 7,9) que contenía el inhibidor de proteasa. fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). La purificación de proteínas se realizó utilizando la resina de purificación de proteínas HisLink de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega). Mediante SDS-PAGE, se separaron cinco μg de proteína de cada muestra. Las bandas de proteínas se analizaron mediante tinción con azul de Coomassie y se identificaron mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo específico de la etiqueta His6.

La LDH de corazón bovino se obtuvo de Sigma-Aldrich y se diluyó con Na3PO4 10 mM a pH 7,4 según las instrucciones del fabricante. Se transfirió un μl de 20 μg/μl de LDH a un tampón que contenía 20 μl de PdLEA2 o BSA en tres proporciones de masa diferentes (LDH: LEA/BSA), que fueron 1:1, 1:20 y 1:40. El secado al vacío de las muestras se realizó en un Speed ​​Vac hasta 6 μl de volumen final que fueron rehidratados con la introducción de 14 μl de tampón. El impacto del calentamiento se probó con el tratamiento de la muestra a 50 °C durante hasta 60 min. La actividad enzimática se determinó añadiendo un ml de tampón de ensayo recién ensamblado (a pH 7,4 de Na3PO4 10 mM, con NADH 2 mM y ácido pirúvico 10 mM) a las muestras de enzima LDH. A 340 nm, se observó oxidación de NADH durante 3 minutos, durante los cuales estuvo presente una velocidad de reacción lineal. La actividad enzimática se calculó utilizando la tasa de disminución de la absorbancia (ΔOD/min) × 8095 = U l−1. Las muestras de ensayo se analizaron por triplicado.

El efecto de las proteínas PdLEA2 sobre la termoestabilidad de la enzima bglG se probó utilizando proteínas PdLEA2 purificadas a una concentración óptima de 0,5 µg ml-1 como aditivo en el ensayo bglG para dos temperaturas diferentes, 50 °C como temperatura óptima y 70 °C. durante el cual su eficiencia catalítica se pierde drásticamente. La enzima bglG de Aspergillus niger se obtuvo de Megazyme y se utilizó según las instrucciones del fabricante. La estabilidad térmica de bglG se midió mediante la incubación de la enzima purificada a las temperaturas requeridas durante intervalos de 30 minutos, utilizando 1 mM de para-nitrofenil β-D-glucopiranósido como sustrato, seguido de la medición de la actividad relativa. La reacción se detuvo con la adición de 0,6 ml de tampón glicina-NaOH 0,4 M (pH 10,8) y el p-nitrofenol liberado se evaluó a 400 nm. Se utilizó 18.000 M-1 cm-1 como coeficiente de extinción molecular del p-nitrofenol. Una unidad de actividad enzimática se determinó como la cantidad de bglG necesaria para liberar un mol de p-nitrofenol en las condiciones del ensayo por minuto.

Se evaluaron varios parámetros físicos y químicos de las proteínas PdLEA2, incluida la masa molecular, el pI teórico, el índice de inestabilidad, el índice alifático y el gran promedio de hidropatía (GRAVY), utilizando Exapsy ProtParam62. El análisis de hidropatía de las secuencias de la proteína PdLEA2 se realizó utilizando Expasy ProtScale basado en la escala de Kyte y Doolittle62. Las regiones desordenadas en las secuencias de proteínas se analizaron utilizando un CS-BLAST frente a la Base de datos de predicciones de proteínas desordenadas (D2P2)63, que agrega resultados de varias herramientas de predicción de trastornos y DISOPRED64. Los dominios conservados se analizaron utilizando la herramienta CD-Search del NCBI y los motivos proteicos de las secuencias de PdLEA2 se identificaron utilizando EM múltiple para obtención de motivos (MEME)65. La predicción de la estructura secundaria se realizó utilizando PSIPRED66 y las regiones transmembrana (TM) se predijeron utilizando MEMSTAT67, DeepTMHMM68 y TOPCONS69. Los modelos de la estructura tridimensional de las secuencias de PdLEA2 se generaron utilizando una instalación interna de AlphaFold270.

Para generar un árbol filogenético de proteínas PdLEA2, todas las secuencias de proteínas LEA2 de P. dactylifera disponibles se obtuvieron de la base de datos NCBI RefSeq Protein. La presencia de la superfamilia LEA2 se confirmó en estas secuencias utilizando la herramienta CD-Search del NCBI. Las secuencias obtenidas y las de PdLEA2 informadas aquí se alinearon utilizando MAFFT versión 4.79071 en Geneious Prime 2022.2.2 (//www.geneious.com). Se generó un árbol filogenético utilizando la herramienta Filogenia simple de EBI utilizando el método de unión de vecinos. El árbol fue visualizado, anotado y renderizado usando Interactive Tree of Life v572.

Se calcularon parámetros estadísticos como la media y la desviación estándar (DE) para el nivel de expresión de los genes PdLEA2 y las actividades enzimáticas de LDH y bglG en condiciones de estrés por calor con diferentes tratamientos con la proteína PdLEA2. Se utilizaron tres réplicas biológicas para cada uno de los ensayos enzimáticos y análisis de expresión de PdLEA2. Los datos se analizaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba HSD de Tukey para la evaluación de diferencias significativas entre las proteínas PdLEA2 y los tratamientos de control bajo estrés por calor. Se evaluó la normalidad y homocedasticidad de cada una de las variables. Los análisis se realizaron utilizando el software estadístico R.

Las secuencias del gen LEA2 de la palmera datilera están disponibles en NCBI DataSets (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) con los números de acceso. OQ348181.1 (PdLEA2.2), OQ348184.1 (PdLEA2.3), OQ348183.1 (PdLEA2.4), OQ348182.1 (PdLEA2.6) y OQ348185.1 (PdLEA2.7). Todos los demás datos del estudio se incluyen en el artículo y en información adicional como archivos complementarios.

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Este trabajo de investigación fue financiado por la subvención de la Oficina de Investigación de la Universidad de los Emiratos Árabes Unidos, 31R203 y la subvención SURE plus G00003906 para KM.

Estos autores contribuyeron igualmente: Mughair Abdul Aziz, Miloofer Sabeem.

Departamento de Agricultura Integrativa, Facultad de Agricultura y Medicina Veterinaria, Emiratos Árabes Unidos, Universidad de los Emiratos, Al‑Ain, Abu‑Dhabi, EAU

Mughair Abdul Aziz, Miloofer Sabeem, Shafeeq Rahman, Maitha Khalfan Alneyadi, Alia Binghushoom Alkaabi, Eiman Saeed Almeqbali y Khaled Masmoudi

Departamento de Ciencias Vegetales, Facultad de Agricultura, Universidad Agrícola de Kerala, Vellanikkara, Thrissur, 680656, India

M. Sangeeta Kutty

Laboratorio de Biotecnología y Mejoramiento Vegetal, Centro de Biotecnología de Sfax (CBS)/Universidad de Sfax, Sfax, Túnez

Preocupación faical

Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de los Emiratos Árabes Unidos, Al‑Ain, Abu‑Dhabi, EAU

Ranjit Vijayan

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KM, MA y MS concibieron la idea y escribieron el manuscrito original. MSK, SR, MA, MS, FB, MKA, ABA y ESA realizaron diferentes experimentos relacionados con la expresión génica y la termotolerancia enzimática. RV realizó e interpretó el análisis estructural y bioinformático. KM y MA realizaron el análisis e interpretación de los datos de expresión. KM, MA y RV revisaron y editaron el borrador final. Todos los autores han leído y aprobado la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Khaled Masmoudi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Aziz, MA, Sabeem, M., Kutty, MS et al. Función de estabilización enzimática y termotolerancia de las proteínas LEA2 intrínsecamente desordenadas de la palmera datilera. Representante científico 13, 11878 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38426-w

Descargar cita

Recibido: 20 de marzo de 2023

Aceptado: 07 de julio de 2023

Publicado: 23 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38426-w

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