Impacto de la hidroxicloroquina profiláctica sobre el deterioro ultraestructural y el SARS celular

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12733 (2023) Citar este artículo

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Se recomendaron muchos medicamentos como agentes antivirales para el control de infecciones y terapia eficaz para reducir la tasa de mortalidad de los pacientes con COVID-19. La hidroxicloroquina (HCQ), un fármaco antipalúdico, se ha recomendado de forma controvertida para uso profiláctico en muchos países, incluida la India, para controlar las infecciones por SARS-CoV-2. Hemos explorado el efecto de la HCQ profiláctica de las células de los fluidos de lavado broncoalveolar de pacientes con síndrome de dificultad respiratoria aguda inducido por COVID-19 para determinar el nivel de infección y las alteraciones ultraestructurales en el epitelio ciliado, los neumocitos tipo II, los macrófagos alveolares, los neutrófilos y granulocitos enucleados. La investigación ultraestructural del epitelio ciliado y los neumocitos tipo II mostró menos infecciones y deterioro celular en el grupo profiláctico HCQ+ que en el grupo HCQ-. Sin embargo, los macrófagos y neutrófilos mostraron infecciones y alteraciones ultraestructurales similares en ambos grupos de pacientes. Los fragmentos enucleados de granulocitos mostraron fagocitosis del virus maduro en los grupos HCQ+. El presente informe revela la prueba ultraestructural para complementar la paradoja sobre el papel de la HCQ profiláctica en pacientes con COVID-19.

El brote de COVID-19 causado por el síndrome respiratorio agudo grave coronavirus-2 (SARS-CoV-2) se ha propagado rápidamente y casi 500 millones de seres humanos infectados en todo el mundo1. Hubo informes insignificantes sobre tratamientos específicos y efectivos para esta infección mortal. Debido a los brotes repentinos y la mortalidad muy alta (29%)2 por la variante delta, se llevaron a cabo muchos ensayos aleatorios y reutilización de medicamentos existentes para controlar y curar la enfermedad COVID-192,3. La hidroxicloroquina (HCQ), un fármaco antipalúdico, ha ganado una atención significativa en la fase inicial de la COVID-19 desde mayo de 2020 en adelante4,5. Anteriormente se informó que este medicamento era eficaz (in vitro) para reducir la internalización viral (al bloquear la activación proteolítica de la proteína S) y la replicación (aumentando el ambiente ácido del endosoma para inhibir el ensamblaje viral), incluido el SARS-CoV-2 y MERS-CoV6,7,8. El efecto anti-SARS-CoV-2 de la HCQ (al inhibir la internalización y la proliferación) se propuso debido a su capacidad para aumentar la acidificación endosómica, la reducción de la activación de la catepsina L, la interferencia con la glicosilación terminal de ACE-2, la autoactivación proteolítica de la furina, y el bloqueo de la endocitosis mediada por clatrina4,9,10,11. Se propuso que los efectos inmunomoduladores, la alcalinización del pH vacuolar, los ionóforos de zinc y la capacidad de unión de la HCQ a los ácidos siálicos inhiben la infección por COVID-19 in vitro de forma no específica9,12,13,14.

Se iniciaron muchos ensayos clínicos en varios países para investigar el efecto de la HCQ en el control y la cura de la enfermedad COVID-1915,16,17. Se informó que la HCQ fue muy eficaz para reducir la multiplicación del virus SARS-COV-2 en condiciones de cultivo in vitro utilizando células Vero E6 con una concentración de 6,90 µM (EC)9018. Este medicamento se recetó en China a dosis de 500 mg dos veces al día durante diez días para la infección leve, moderada y grave por SARS-CoV-2. El centro holandés para el control de enfermedades sugirió 600 mg de cloroquina base (6 tabletas A-CQ de 100 mg) seguidos de 300 mg después de 12 h el día 1, luego 300 mg los días 2 a 5. Para superar el aumento de COVID-19 en 2020, el Consejo Indio de Investigación Médica publicó un aviso para conceder HCQ (400 mg dos veces el primer día después de la dosis de 400 mg una vez a la semana durante 3 a 7 semanas) como dosis de profilaxis antes. cualquier síntoma surge para reducir el riesgo de infección19. Se informó que este tipo de dosificación oral logra una concentración farmacológica favorable in vivo debido a la farmacología muy efectiva de este fármaco20,21,22.

Se encontró que la hidroxicloroquina (HCQ), un derivado de la cloroquina, es más eficaz debido a su mejor solubilidad en agua, baja toxicidad y circulación más prolongada5,8,18,23. Un ensayo clínico aleatorizado de Pujol et al. muestra la seguridad de la HCQ en dosis bajas24. El estudio de Serrano et al. informaron la eficacia de la HCQ para minimizar la infectividad viral hasta cierto punto25. Teniendo en cuenta muchos hallazgos farmacológicos similares, este fármaco se introdujo ofensivamente como agente profiláctico para controlar la infección viral por SARS-CoV-2 a pesar de los efectos secundarios asociados. Sin embargo, el impacto insignificante de la HCQ en la COVID-19 se informó utilizando líneas celulares calu-3 (adenocarcinoma de pulmón) y macaco cangrejero in vivo en los últimos meses del año 202011,26. Varios estudios han revelado dudas sobre la acción de las HCQ en el control de la infección por COVID-1927. Debido a la insignificante reducción de la mortalidad en los pacientes ingresados por COVID-19, la OMS (organización mundial de la salud) también había anunciado la insuficiencia de la HCQ en el tratamiento de la enfermedad COVID28. Sin embargo, la insatisfacción con la eficacia de la HCQ según el número de ensayos clínicos no debe interpretarse como la falta de eficacia de este fármaco como agente antiviral de amplio espectro. El estudio de Pandolfi et al. sobre los niveles de citocinas celulares y variables en BALF implica que el efecto anti-SARS-CoV-2 del fármaco HCQ podría explorarse mediante un examen ultraestructural de pacientes tratados con HCQ29,30. Varios informes publicados a mediados de 2020 (marzo a octubre de 2020) respaldaron los efectos positivos de la HCQ en el control de la infección y multiplicación del virus SARS-CoV-24,16,31,32,33,34,35,36. Liu y cols. demostró in vitro que la HCQ bloquea el transporte del SARS-CoV-2 desde los endosomas tempranos a los endolisosomas, lo que resulta en un número más significativo y anormalmente agrandado de vesículas endosómicas tempranas4. Un estudio realizado por Ruiz et al. (2021) revelaron la presencia de una concentración farmacológica de HCQ en el líquido del revestimiento epitelial y del pulmón (superior al epitelio) de pacientes con COVID-19 intubados37. Sin embargo, muchos informes editoriales e iniciales sospechaban de la eficacia de la HCQ en el COVID-19. Advirtieron sobre el efecto adverso del uso indiscriminado respaldado por investigaciones que demuestran la ineficacia del HCQ en el control o cura del COVID-198,38,39,40,41,42. Varios ensayos clínicos mostraron un efecto insignificante de la HCQ en pacientes con COVID-1927. Teniendo en cuenta el controvertido informe sobre el impacto de la HCQ en COVID-19 en condiciones in vitro e in vivo, este estudio fue diseñado para explorar el efecto de la HCQ en el nivel ultraestructural de las diversas células de los fluidos de lavado broncoalveolar (BALF) de pacientes gravemente infectados. y pacientes intubados con COVID-19. Hemos comparado las ultraestructuras del epitelio ciliado, los neumocitos tipo II, los macrófagos alveolares, los neutrófilos y los granulocitos enucleados del BALF de pacientes con SDRA leve (intubados debido a una condición traumática, HCQ-) y con SDRA grave con y sin HCQ profiláctico. .

Se evaluó el efecto de la HCQ tomada de forma profiláctica (tomada por el individuo sano antes de la infección por SARS-CoV-2, HCQ+) en diferentes células del BALF de pacientes con SDRA grave (intubados) en función del nivel de infección y alteraciones ultraestructurales. Estos hallazgos ultraestructurales se compararon con los pacientes con SDRA grave que no tomaron HCQ como dosis profiláctica (HCQ-). Para este estudio se reclutó a pacientes que habían tomado HCQ profiláctico y posteriormente desarrollaron SDRA inducido por SARS-CoV-2 (Tablas complementarias S2 y S3). Todos los pacientes con SDRA que recibieron HCQ después de la infección fueron excluidos del estudio. En este estudio también se reclutó a pacientes leves con COVID-19 (sin SDRA) para evaluar el impacto del SDRA inducido por el SARS-CoV-2 en el nivel de infección y la modulación ultraestructural de las células BALF. Estos pacientes fueron intubados por traumatismo y posteriormente infectados con SARS-CoV-2, presentando un cuadro clínico leve (fig. 1). En este estudio se examinaron los efectos de la HCQ sobre la ultraestructura del epitelio ciliado, los neumocitos tipo II, los macrófagos, los neutrófilos y los granulocitos enucleados.

Diseño de estudio para evaluar el efecto de la HCQ profiláctica sobre la ultraestructura de varias células BALF. Las muestras BALF (32 muestras) se recogieron de los pacientes intubados. Los pacientes finalmente se agruparon en (a) grupo HCQ- sin SDRA, (b) grupo HCQ-, SDRA y (c) grupo HCQ+. Los pacientes con COVID-19 leve (A) fueron intubados debido a una condición traumática (no debido a SDRA inducido por COVID-19) pero dieron positivo a COVID-19 mediante RT-PCR. Se tomó el BALF de estos pacientes para explorar los cambios ultraestructurales entre los grupos profilácticos HCQ+ y HCQ-. Los tres grupos fueron seleccionados para diferenciar el efecto de la HCQ profiláctica sobre los cambios ultraestructurales en el epitelio ciliado, neumocitos tipo 2, macrófagos alveolares, neutrófilos y fragmentos citoplasmáticos no nucleados del BALF. El número de pacientes reclutados en este estudio se indicó junto con cada subgrupo.

Las células epiteliales ciliadas del BALF de pacientes con infección leve (sin SDRA, HCQ-) mostraron una estructura celular intacta, citoplasma vacuolado con un núcleo denso (en imágenes de PAP) y una infección celular leve (Tabla 1) bajo inmunofluorescencia (IF). imágenes (Fig. 2a). La ultraestructura de la superficie bajo imágenes SEM mostró muchas estructuras similares a virus en el cuerpo de las células y los cilios (Fig. 2a). Las imágenes TEM de estas células mostraron mitocondrias sanas, muchos complejos ciliares basales (características identificables para las células ciliadas) y algunas estructuras similares a virus (<100 nm) en la membrana plasmática y en el citoplasma periférico. No pudimos encontrar ninguna partícula similar a un virus que contenga vesículas unidas a membranas en estas células (Fig. 2a). Estas células de los pacientes con SDRA sin HCQ (HCQ-) mostraron un citoplasma altamente vacuolado (indicativo de una mayor carga viral), con un núcleo denso bajo microscopía óptica y una mayor inmunofluorescencia (alta infección) (Fig. 2b). Un microscopio electrónico de barrido mostró una morfología celular esquelética con muchas partículas similares a virus en el cuerpo y los cilios de las células (Fig. 2b). La TEM reveló muchas vesículas unidas a membranas con partículas granulares similares a virus (flecha). Muchos cuerpos ciliares basales se consideraron características identificables de las células ciliares. La desaparición de la membrana plasmática y las mitocondrias inflamadas mostraron características iniciales típicas de tipo apoptótico indicativas de una mayor infección viral (Fig. 2b).

Epitelio ciliado del BALF de un paciente intubado con COVID-19. (a) Grupo HCQ- con infección leve (no SDRA), (b) Infección grave (SDRA) HCQ- y (c) Infección grave (SDRA) con grupo HCQ+ profiláctico. Se tomaron imágenes del epitelio ciliado de cada grupo de pacientes utilizando la prueba PAP para la identificación de varias células en BALF (PAP), inmunofluorescencia (imagen fusionada de DIC, DAPI y Alexa flor 598) utilizando imágenes específicas de la proteína S del virus SARS-CoV-2. anticuerpo para la determinación del nivel de infección a través del software Fiji (IF), microscopía electrónica de barrido para obtener imágenes de la superficie del virus y visualizar la morfología celular (SEM), y detalles ultraestructurales celulares mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). El nivel de infecciones fue más alto en el grupo de pacientes B, seguido de los grupos A y C. Los cilios estaban prácticamente intactos en cada grupo de pacientes. Se observaron partículas de virus similares al SARS-CoV-2 en la superficie y en la membrana celular (flechas). El daño ultraestructural fue más prominente en el grupo de pacientes b, seguido de los grupos cy a. N Núcleo, C Cilios, M Mitocondrias, flechas virus SARS-CoV-2.

Los pacientes con SDRA grave con HCQ profiláctica (HCQ+) mostraron células epiteliales ciliadas relativamente sanas en imágenes de PAP con citoplasma activo y núcleo normal con nucléolo. Estas células mostraron significativamente menos inmunofluorescencia, lo que indica una infección leve en estas células. La ultraestructura superficial de estas células mostró una apariencia saludable de las células con muy pocas partículas similares a virus en la membrana plasmática y los cilios. Las imágenes con microscopio electrónico de transmisión mostraron mitocondrias sanas, citoplasma denso, núcleo excéntrico, vesículas unidas a membrana insignificantes, muchas estructuras similares a virus en la superficie exterior de la membrana plasmática y vacuolas típicas (Fig. 2c).

Los neumocitos tipo II de pacientes con COVID-19 leve (sin SDRA, HCQ-) exhibieron un núcleo denso con citoplasma vacuolado e inmunofluorescencia leve. Sin embargo, las ultraestructuras superficiales de estas células estaban cubiertas con morfologías típicas similares a microvellosidades múltiples, que sugieren células sanas (Fig. 3a). Las imágenes TEM revelaron el núcleo excéntrico, con muchos gránulos de surfactante intactos, cuerpo lipídico, mitocondrias sanas y cuerpos residuales. La presencia de muchos gránulos de ferritina indica la condición de estrés oxidativo de las células en la etapa de infección leve. Muchas partículas similares a virus estaban presentes en la membrana plasmática de estas células y en las proyecciones citoplasmáticas (Fig. 3a). Sin embargo, los neumocitos tipo II alteraron su morfología en condiciones graves de SDRA (HCQ-). Muestra inmunofluorescencia de moderada a alta como signo de mayor infección (Tabla 1). SEM reveló la morfología hinchada, pérdida de curvaturas, reducción de microvellosidades y aumento del tamaño de las células. TEM mostró un núcleo completamente desintegrado, muchas vesículas unidas a membranas, muchas partículas similares a virus en las vesículas unidas a membranas, citoplasma vacuolizado, cuerpo lipídico magro y muchos gránulos de surfactante liberados. Todos estos hallazgos indican el alto estrés y la condición apoptótica inicial de estas células bajo la influencia de infecciones altas por SARS-CoV-2 (Fig. 3b).

Neumocitos tipo II del BALF de pacientes intubados con COVID-19. (a) Grupo HCQ− con infección leve (sin SDRA), (b) Infección grave (SDRA) sin HCQ (HCQ−) y (c) Grupo con infección grave (SDRA) con HCQ profiláctica (HCQ+). Estas células mostraban una proyección de membrana, un rasgo característico de los neumocitos tipo II. La infección fue mayor en los pacientes del grupo B, seguida de los grupos A y C. Esto indica la eficacia de la HCQ para proteger la infección en estas células del virus SARS-CoV-2. Las imágenes SEM confirman la presencia de una estructura similar a microvellosidades junto con partículas similares a virus en la superficie (flecha). Las características del cuerpo laminar estaban intactas y tenían una morfología clara y distinguible en el grupo C; sin embargo, estos fueron liberados en los pacientes del grupo B. N Núcleo, M Mitocondrias, L Cuerpo lipídico, LB Cuerpo laminar, flechas Virus SARS-CoV-2.

Sin embargo, el paciente del grupo profiláctico HCQ+ presentó células y núcleos más sanos en las imágenes de microscopio óptico, con una inmunofluorescencia significativamente menor. La infección menor puede deberse a la menor internalización y multiplicación del SARS-CoV-2 bajo la influencia de la HCQ. Estas células de los pacientes con HCQ+ profiláctico mostraron una morfología de superficie normal en imágenes SEM. Sin embargo, algunas células mostraron necrosis con muchos gránulos de surfactante en las imágenes TEM (Fig. 3c). Muchas células mostraron una morfología intacta con un núcleo estresado pero gránulos de surfactante intactos.

Para identificar y comparar las alteraciones ultraestructurales en los macrófagos alveolares de SDRA leve y grave (HCQ-) y HCQ+ profiláctico, se tomaron imágenes de pacientes mediante PAP, IF, SEM y TEM para observar el número de proyecciones de superficie, ultraestructura y citoplasma junto con la presencia de partículas parecidas a virus. Los macrófagos de pacientes con infección leve mostraron un citoplasma relativamente vascular y un núcleo denso con infecciones de moderadas a graves (Tabla 1). La morfología de la superficie mediante imágenes SEM mostró una superficie rugosa típica con la presencia de muy pocas estructuras similares a virus. TEM reveló un núcleo en forma de herradura con eucromatina periférica, nucleolo, citoplasma denso, múltiples fagosomas y menos proyección citoplasmática indicativa de células sanas (Fig. 4a). Los pacientes con SDRA (HCQ-) mostraron células de macrófagos alveolares proliferativas con inmunofluorescencia muy alta. La morfología de la superficie mostró el típico macrófago hiperactivo con muchos virus en la superficie. Estas células mostraron un núcleo apoptótico inicial con fagosomas de gran tamaño llenos de partículas similares a virus (flecha). Esto especifica la condición altamente proliferativa de estas células bajo la influencia de tormentas de citoquinas (Fig. 4b). Este macrófago de los pacientes con HCQ+ profiláctico mostró una infección moderada y una morfología de superficie proliferativa. Sin embargo, la TEM reveló un núcleo sano y células con muchos fagosomas llenos. La alteración ultraestructural fue similar a la del grupo HCQ- (Fig. 4c).

Macrófagos/monocitos del BALF de pacientes intubados con COVID-19. (a) Infección leve (no SDRA) y grupo HCQ− (b) Pacientes con infección grave (SDRA) sin HCQ (HCQ−) y (c) Infección grave (SDRA) con grupo profiláctico HCQ (HCQ+). El estudio IF mostró una infección grave en todos los grupos de pacientes, lo que indica el papel ineficaz de la HCQ en los macrófagos alveolares. Las imágenes SEM mostraron múltiples estructuras similares a virus en la superficie celular (flechas) con morfología de superficie similar en pacientes con SDRA (b, c). Las imágenes TEM revelan fagosomas en el citoplasma celular con muchos virus (flechas). Hubo daño ultraestructural similar en los grupos de pacientes con SDRA (b, c). El grupo sin SDRA (a) mostró una ultraestructura celular intacta incluso con una infección más alta. Núcleo N, Mitocondrias M, Cuerpo Residual RB, Fagosoma P, flechas virus SARS-CoV-2.

Los neutrófilos de la muestra BALF de pacientes con infección leve mostraron un citoplasma vascular con un núcleo multilobulado con inmunofluorescencia leve. La morfología de la superficie mostró un cuerpo celular encogido bajo imágenes SEM. Sus núcleos exhibían condiciones similares a las del estrés con una acumulación periférica de heterocromatina y eucromatina ubicada centralmente. La presencia de mitocondrias sanas múltiples y dispersas con otros orgánulos citoplasmáticos confirma los neutrófilos activados sin trampas extracelulares de neutrófilos (NET) (Fig. 5a). Sin embargo, los núcleos densos y los citoplasmas condensados bajo microscopía óptica de pacientes con SDRA grave confirmaron la alta condición proliferativa de estas células con muchas estructuras similares a NET. Estas células también mostraron una inmunofluorescencia relativamente mayor, lo que sugiere una infección grave. La ultraestructura de la superficie mostró muchas estructuras similares a NET que designan las condiciones de alto estrés en estas células. TEM reveló un núcleo más heterocromático, lo que indica la condición apoptótica inicial con muchas vacuolas que tienen estructuras similares a virus y muchos NET. La menor cantidad de mitocondrias con muchos virus en la superficie celular confirman la condición apoptótica inicial causada por la infección viral por SARS-CoV2 (Fig. 5b).

Neutrófilos del BALF de paciente intubado con COVID-19. (a) Grupo HCQ− con infección leve (sin SDRA), (b) Pacientes con infección grave (SDRA) sin HCQ (HCQ−) y (c) Grupo con infección grave (SDRA) con HCQ profiláctica (HCQ+). Se observó núcleo multilobulado en desintegración con NET externos en todos los subgrupos de pacientes. El nivel de infección (IF) fue significativo en los grupos de SDRA (b) y (c) y leve en el grupo (a). La HCQ no tiene efectos sobre las células neutrófilos para el control de la infección y la internalización del virus. Las imágenes SEM mostraron múltiples estructuras similares a virus en la superficie celular. Las imágenes TEM revelan fagosomas en el citoplasma celular con muchos virus (flechas). La HCQ no mostró un efecto protector sobre la infección de estas células. Núcleo N, Mitocondrias M, Cuerpo Residual RB, Fagosoma P, Trampas extracelulares de neutrófilos Nt, flechas virus SARS-CoV-2.

Los neutrófilos de los pacientes con SDRA grave que recibieron HCQ+ de forma profiláctica mostraron una mejor morfología celular y nuclear con infecciones relativamente moderadas, como lo indica la inmunofluorescencia (Tabla 1). Sin embargo, la morfología de la superficie reveló muchos NET pequeños como proyecciones. Las proyecciones de estos NET también se apreciaron en las imágenes del microscopio electrónico de transmisión con muchas vacuolas que contienen partículas inmaduras similares a virus, núcleos ricos en heterocromatina y muchas mitocondrias pequeñas. Estos neutrófilos mostraron una condición proliferativa similar a la del grupo HCQ- (Fig. 5c).

BALF contiene muchas células enucleadas derivadas de los granulocitos de la sangre después de la degradación del núcleo bajo la influencia de una infección superior del SARS-CoV-2. Estas estructuras citoplasmáticas mostraron una intensa fluorescencia, lo que sugiere altas cargas virales. No pudimos encontrar granulocitos enucleados en los pacientes con infección leve. Los pacientes con SDRA mostraron una alta inmunofluorescencia con estructuras similares a NET en la superficie. TEM reveló muchos virus en las vesículas unidas a membranas sin núcleo. Hemos seccionado y tomado imágenes de estas células en su totalidad, pero no pudimos localizar la presencia de un núcleo mediante TEM. Algunas vacuolas periféricas mostraron la liberación del virus en la superficie de las células (Fig. 6a). Los pacientes con HCQ profiláctica mostraron citoplasma granular, infección de moderada a grave, como lo indica la inmunofluorescencia alta. La morfología de la superficie era una estructura redondeada típica con muchas partículas maduras similares a virus. TEM exhibió fragmentos excéntricamente diminutos de ligeros residuos nucleares, con muchas vesículas, fagosomas y pequeñas partículas de virus, lo que confirma el virus SARS-CoV-2. Las células del grupo HCQ+ mostraron una fagocitosis muy alta del virus maduro SARS-CoV-2 (Fig. 6b).

Granulocitos enucleados del BALF de un paciente intubado con COVID-19. (a) pacientes con SDRA sin HCQ (HCQ-) y (b) grupo con SDRA con HCQ profiláctica (HCQ+). Se observaron muchas células no nucleadas en BALF, que tenían el nivel más alto de infección por SARS-CoV-2 en comparación con otras células. Estas células mostraron origen de granulocitos mostrando CD15 positivo. Las imágenes TEM mostraron fagosomas altamente vacuolados en ambos grupos. Sin embargo, las células del grupo tratadas con HCQ mostraron fagosomas completamente llenos con virus maduros. Flechas del virus SARS-CoV-2.

En este estudio comparativo, se evaluaron los efectos de la HCQ en diferentes células encontradas en el BALF de pacientes con COVID-19 con respecto al nivel de infección viral por SARS-CoV-2, el impacto en la superficie celular y otros orgánulos celulares (ultraestructura). mediante microscopía óptica y electrónica. Este estudio se realizó en muestras BALF de pacientes intubados con COVID-19 positivos para comprender el efecto de HCQ+ versus HCQ− mediante comparación ultraestructural y nivel de infección. BALF demostró ser una muestra valiosa para estudiar la proliferación del virus SARS-CoV-2 y los efectos de la HCQ profiláctica sobre la COVID-19. El examen con microscopio electrónico de las células infectadas con SARS-CoV-2 se realizó para evaluar el impacto de la HCQ en los cambios ultraestructurales y la propagación viral en pacientes con SDRA grave. Las células del epitelio ciliado de pacientes con HCQ+ profilácticos mostraron una infección (inmunofluorescencia) y un núcleo/citoplasma sanos significativamente menores que el grupo HCQ- (Fig. 2). Este especifica que la HCQ profiláctica desempeña un papel preventivo en la internalización del virus SARS-CoV-2 en el epitelio ciliado. Relativamente menos viriones en las características vesículas unidas a membranas, revestimiento viral en la superficie celular y una menor cantidad de vesículas de doble membrana en pacientes HCQ+ proporcionan evidencia clara de la reducción de la infección por SARS-CoV-2 (Fig. 2). Esto también sugiere la reducción de la replicación de partículas virales en el epitelio ciliado del grupo HCQ+ durante la fase tardía de la infección. Las células infectadas con SARS-CoV-2 suelen mostrar una morfología irregular y se extienden desde el borde hasta el centro de la capa celular. Estas células infectadas también mostraron una aparición gradual de pequeños agregados y un aumento de partículas intersticiales. Las células enfermas se redondearon, se condensaron, se separaron o se fusionaron43. En nuestro estudio, las células HCQ+ mostraron cambios relativamente menores, lo que prueba indirectamente el impacto de la HCQ en el control de la infección en estas células a nivel ultraestructural (Fig. 2).

Las células de los neumocitos tipo II liberan surfactantes, que desempeñan un papel importante en la defensa inmune y en la regeneración de las vías respiratorias durante una lesión pulmonar44. Estas células del grupo HCQ+ mostraron un citoplasma relativamente sano con menor infección que los pacientes leves y con SDRA sin HCQ profiláctica (grupo HCQ-). Esto proporciona evidencia directa del control de la infección mediante la profilaxis HCQ+ en estas células. Ya se informó que los neumocitos tipo II tienen un nivel más alto de HCQ en el grupo de pacientes profilácticos que cualquier otra célula de los pulmones37. Se observó un número significativamente menor de cuerpos hemilaminares característicos (generados debido a una infección viral) entre estas células bajo microscopía electrónica en comparación con pacientes con SDRA grave (Fig. 3). Estos orgánulos estaban llenos de números desiguales de viriones maduros en el retículo endoplásmico rugoso y las vesículas marcadamente expandidos. Las partículas virales en estas células se observaron como objetos circulares en las vesículas, que pueden ser cuerpos polivacuolares o vesículas autofágicas que engullen partículas. Las imágenes TEM de estas células mostraron que el SARS-CoV-2 se internalizó en las células mediante la fusión de membranas y maduró en vesículas (Fig. 3).

El análisis histopatológico de BALF de pacientes con SDRA reveló respuestas fibroproliferativas de macrófagos alveolares con daño alveolar difuso en todos los grupos de pacientes. Los cambios insignificantes en la ultraestructura de los macrófagos alveolares de pacientes con infección leve pueden deberse a un bajo nivel de infección. Las ultraestructuras revelaron que estos macrófagos no estaban activados. Se ha informado que la activación de monocitos y macrófagos es la causa principal del síndrome inflamatorio similar al SDRA al expresar de 2 a 3 veces más citoquinas inflamatorias45,46. Sin embargo, en pacientes con SDRA grave, la apariencia espumosa indica macrófagos hiperactivos y apoptóticos. Esto se debe a los distintos tamaños de vesículas y a la acumulación de fibrina en las proximidades de la membrana celular. Una morfología similar de estos macrófagos en el grupo HCQ+ no reveló ningún efecto de la HCQ en la ultraestructura celular (Fig. 4).

La replicación viral dentro de las células alarma una lesión celular que conduce a la segunda línea de la respuesta innata mediante la liberación de mediadores inflamatorios. Debido a la inflamación, los neutrófilos y monocitos circulantes se apresuran al sitio de la infección, donde inician la fagocitosis del virus invasor. La ultraestructura celular normal de los neutrófilos del grupo de pacientes con infección leve indicó menos inflamación. Sin embargo, se observó un efecto citopático aparente en el grupo de pacientes graves y con HCQ+, que no muestra ningún efecto protector contra infecciones de la HCQ en estas células. El citoplasma vacuolar con abundante estructura similar a un virus y NET eran indicadores de neutrófilos activados (Fig. 5).

Múltiples células anucleadas o sus fragmentos con un nivel muy alto de infección en pacientes con SDRA grave con y sin HCQ indican el impacto insignificante de las HCQ en estas células. Estas células han identificado un granulocito debido a CD 15 positivo en la inmunohistoquímica47. Las vesículas fagocíticas estaban llenas de virus maduros, lo que indica que las HCQ pueden aumentar la actividad fagocítica de los granulocitos (Fig. 6).

Este estudio destacó el nivel de infección por SARS-CoV-2 y alteración ultraestructural en el grupo profiláctico HCQ+ en comparación con el grupo HCQ- del epitelio ciliado, neumocitos tipo II, macrófagos alveolares, neutrófilos y granulocitos anucleados individualmente. Encontramos la importante actividad antiviral de la HCQ como una función protectora en lugar de un efecto degenerante sobre el epitelio ciliado y los neumocitos tipo II en los que se observó un bajo nivel de infección y una ultraestructura celular relativamente intacta. La ultraestructura de los macrófagos alveolares y los neutrófilos se degeneró en pacientes con SDRA tanto del grupo HCQ+ como del grupo HCQ-. Sin embargo, los fragmentos enucleados de granulocitos mostraron una mayor tendencia a la fagocitosis del virus maduro SARS-COV-2 en el grupo HCQ+.

BSA y etanol se adquirieron de Himedia. Triton X-100 se adquirió de Fisher Scientific. El tetróxido de osmio se adquirió de Ted Pella, EE. UU. El acetato de uranilo era de TAAB, Reino Unido, y el citrato de plomo, de Ladd. El anticuerpo primario policlonal específico anti-SARS-CoV-2 (n.º de cat. ab275759) y el anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con Alexa fluor-594 (n.º de cat. ab150080) se adquirieron de Abcam, Plc, Reino Unido. El fijador de Karnovsky (0,5 % de glutaraldehído + 2,0 % de paraformaldehído), hematoxilina, eosina, naranja G, agua de Scott, xileno, DPX, PBS, poli-l-lisina, kit de inclusión de epoxi y DAPI se compraron de Sigma Chemical Company, MO, EE. UU. .

Se recogieron BALF de pacientes infectados leves y graves con SARS-CoV-2 (positivos para COVID-19) e intubados de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) después de obtener el consentimiento informado de todos los participantes o representantes de los pacientes. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional (IEC), Instituto Panindio de Ciencias Médicas de Nueva Delhi, India (Ref. No. IEC-307/27.04.2020, RP-10/202). Confirmamos que todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes.

Se recolectaron muestras BALF de pacientes intubados positivos para SARS-CoV-2 en la unidad de cuidados intensivos (UCI) de COVID-19, AIIMS, Nueva Delhi. Todas las muestras se recolectaron entre el 3 de octubre de 2020 y el 31 de enero de 2021 (Tabla complementaria S1). Los pacientes se clasificaron en tres grupos, como (A) pacientes con infección leve sin SDRA (sin SDRA, HCQ-, 11 pacientes), (B) infección grave con SDRA sin HCQS profiláctico (SDRA, HCQ-, 15 pacientes), y (C) pacientes con SDRA grave que habían tomado HCQS antes de la infección por SARS-CoV-2 como dosis profiláctica (SDRA, HCQ+, 06 pacientes) (Fig. 1). Se realizó una prueba RT-PCR para confirmar la infección por COVID-19 en todos los pacientes reclutados en el estudio. Los pacientes que habían tomado HCQ después de los síntomas de COVID-19 fueron excluidos del estudio. Los pacientes con SDRA fueron intubados debido a hipoxemia (SpO2 <90%), alto requerimiento de oxígeno (flujo de 20 a 25 l/min) y deterioro de los problemas respiratorios.

El BALF (15–20 ml) se fijó principalmente en 20 ml recién preparados de solución de Karnovsky 2X (glutaraldehído final al 5% + formaldehído al 4,0%) en tampón fosfato 0,2 M. La superficie de los viales de muestra se esterilizó con una solución de alcohol/jabón mediante incubación durante dos horas a temperatura ambiente y se almacenó a 4 °C en un refrigerador designado para COVID-19. Los registros médicos de todos los pacientes fueron revisados y verificados por un médico de guardia.

Después de la fijación primaria, la solución BALF se diluyó diez veces con una solución de NaCl 0,1 M y se filtró a través de un filtro celular de malla de nailon con un poro de 100 µm. El filtrado se centrifugó a 2500 rpm durante 3 minutos en un cubo oscilante. Los sedimentos celulares se lavaron 2 a 3 veces durante 10 minutos con solución de PBS para eliminar el exceso de moco. El contenido celular se enriqueció mediante centrifugación a 1200 xg durante 3 minutos y se resuspendió nuevamente en el fijador primario A (glutaraldehído al 0,5% y paraformaldehído al 2,0% en tampón PB 0,1 M). Estas muestras se procesaron para tinción con PAP, inmunofluorescencia (IF), microscopía electrónica de barrido y transmisión (SEM, TEM).

BALF se lavó tres veces con tampón fosfato 0,1 M y se prepararon frotis utilizando 10 µl de muestra en portaobjetos de vidrio recubiertos con poli-l-lisina y se secaron al aire a temperatura ambiente (RT). Los frotis se permeabilizaron con PBST (Triton X-100 al 0,1% en solución salina tampón fosfato 1x, PBS) y después del bloqueo de proteínas con BSA al 2% en PBS durante 30 minutos, se incubaron con anticuerpo primario (Abcam ab275759, policlonal contra la proteína de pico S1, dilución 1:500) durante cuatro horas en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de lavar con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo de PBS (anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con fluoróforo Alexa-594, Abcam, n.º de catálogo-150080; dilución 1:500) se añadió durante 1 hora a temperatura ambiente en el cuarto oscuro. Los frotis se lavaron con tampón fosfato y se añadió DAPI (1 μg/ml) durante 5 minutos. El exceso de DAPI se lavó con PBS y los frotis se montaron con glicerol al 90%. Las imágenes de fluorescencia se realizaron en un microscopio confocal de barrido láser (Leica SP8 Alemania).

Para SEM, los componentes celulares fijos primarios y enriquecidos de BALF se osmicaron, se deshidrataron con etanol, se secaron en el punto crítico (E-3100, Quorum Tech) y se montaron en cinta de doble cara en los trozos de aluminio. Estos trozos se recubrieron con un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica a base de oro (HHV BT-150) durante 180 s. Las micrografías electrónicas se obtuvieron en un SEM EVO18 (Zeiss, Alemania) operado a un voltaje de aceleración de 20 kV, con una distancia de trabajo promedio de entre 8 y 10 mm con detector SE y aumentos que oscilaron entre 5000 × y 30 000 ×.

Para preparar las muestras para imágenes TEM, los componentes celulares enriquecidos de BALF se fijaron principalmente utilizando glutaraldehído al 2,5 % + paraformaldehído al 2,0 % en tampón fosfato (PB) 0,1 M. Los sedimentos celulares fijados se lavaron con PB 0,1 M (pH 7,4) y se fijaron posteriormente con tetróxido de osmio al 1% en PB 0,1 M (pH 7,4) durante una hora (fijación secundaria) a 4 °C. Durante dos horas, los sedimentos se lavaron con agua destilada y se tiñó en bloque con acetato de uranilo al 2% en etanol al 50%. Estas muestras se lavaron nuevamente con agua destilada y se deshidrataron en una serie de etanol (50%, 70%, 80%, 90% y 100%). Estos gránulos se infiltraron con tolueno/resina y finalmente se incluyeron en resina Araldite CY212. Los bloques se polimerizaron a 65 °C durante 48 h. Se recortaron los bloques de resina y se prepararon secciones delgadas de 70 nm utilizando un ultramicrótomo UC7 (Leica). Las secciones se montaron sobre rejillas y se tiñeron con acetato de uranilo al 5% y citrato de plomo al 5%. Se tomaron imágenes de las células utilizando un microscopio electrónico de transmisión Talos F200 (Thermo Fisher Scientific) utilizando un filamento FEG operado a 200 kV.

Los conjuntos de datos (imágenes microscópicas de PAP, IF, SEM y TEM) utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles a través del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos a todos los familiares de los pacientes por permitirnos recolectar BALF de los pacientes. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Red Virtual Indo-EE.UU. de IUSSTF para el programa COVID-19 (IUSSTF/VN-COVID/007/2020). Se reconoce otra financiación procedente de subvenciones internas de DBT (BT/INF/22/SP44285/2021), ICMR, SERB y AIIMS. SAIF-AIIMS Nueva Delhi es reconocida como la instalación de imágenes para SEM y TEM. La instalación de microscopio confocal DST-FIST también es reconocida por su instalación de inmunofluorescencia. Agradecimos al Dr. Kapil Soni y al Prof. Anjan Trikha su permiso para recolectar las muestras BALF de las respectivas salas.

Red virtual Indo-EE.UU. de IUSSTF para el programa COVID-19 (IUSSTF/VN-COVID/007/2020) y DBT SAHAJ (BT/INF/22/SP44285/2021).

Instalación de microscopio electrónico, Departamento de Anatomía, Instituto de Ciencias Médicas de toda la India, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Shikha Chaudhary, Arti Joshi, Kishore Sesham, Preeti Rai, Tapas Chandra Nag y Subhash Chandra Yadav

Departamento de Anestesiología, Medicina del Dolor y Cuidados Intensivos, Instituto Panindio de Ciencias Médicas, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Shailendra Kumar

Departamento de Patología, Instituto Panindio de Ciencias Médicas, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Asit Ranjan Mridha

Departamento de Medicina, Instituto Panindio de Ciencias Médicas, Nueva Delhi, Delhi, 110029, India

Upendra Baitha

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SC realizó los experimentos para el procesamiento de muestras, estandarización de imágenes PAP e IF, microscopía electrónica, interpretación de los datos, gestión de registros clínicos y generación de figuras de microscopía. PR realizó las imágenes de inmunofluorescencia, registró los datos clínicos y ayudó a SC con experimentos relacionados con la microscopía electrónica. AJ realizó la prueba de Papanicolaou. KS recogió la muestra de las salas de UCI. SK participó en el diseño del estudio y la estandarización de las estrategias de recolección de muestras. ARM y TCN ayudaron a interpretar los resultados y las imágenes y corregir los manuscritos. ARM y UB también ayudaron en la corrección del manuscrito. SCY diseñó el estudio, realizó y supervisó experimentos con pacientes con COVID-19, analizó los datos, generó las figuras, escribió el manuscrito y dirigió el proyecto. Todos los autores leyeron y aprobaron el borrador final de este manuscrito.

Correspondencia a Subhash Chandra Yadav.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Chaudhary, S., Joshi, A., Sesham, K. et al. Impacto de la hidroxicloroquina profiláctica sobre el deterioro ultraestructural y la infección celular por SARS-CoV-2 en diferentes células de líquidos de lavado broncoalveolar de pacientes con COVID-19. Representante científico 13, 12733 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39941-6

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Recibido: 18 de noviembre de 2022

Aceptado: 02 de agosto de 2023

Publicado: 05 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39941-6

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