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Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4658 (2023) Citar este artículo

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Las tácticas basadas en materiales han atraído una gran atención para impulsar la evolución funcional de los organismos. Con el objetivo de diseñar organismos bioartificiales dirigibles para eliminar virus patógenos transmitidos por el agua, diseñamos Paramecium caudatum (Para), microorganismos unicelulares, con un orgánulo eliminador de virus (VSO) semiartificial y específico. Las nanopartículas magnéticas de Fe3O4 modificadas con un anticuerpo de captura de virus (MNPs@Ab) se integran en las vacuolas de Para durante la alimentación para producir VSO, que persisten dentro de Para sin afectar su capacidad de natación. En comparación con el Para natural, que no tiene especificidad de captura y muestra una inactivación ineficiente, el Para (E-Para) diseñado por VSO recolecta específicamente virus transmitidos por el agua y los confina dentro de los VSO, donde los virus capturados se desactivan por completo porque la nanopartícula similar a la peroxidasa. Fe3O4 produce radicales hidroxilo (•OH) que matan virus dentro del ambiente ácido de VSO. Después del tratamiento, el E-Para magnetizado se recicla y reutiliza fácilmente, evitando una mayor contaminación. Los orgánulos artificiales basados en materiales convierten el Para natural en un eliminador de virus vivo, lo que facilita la eliminación de virus transmitidos por el agua sin un consumo adicional de energía.

La integración de nanomateriales funcionales y organismos puede promover la evolución funcional de organismos vivos con capacidad de respuesta biológica direccionable y amplias perspectivas de aplicación1,2,3 y, por lo tanto, atrae una gran atención en biomedicina4,5,6, fabricación de microrobots7,8,9 y conversión de energía10. ,11 y ciencias ambientales12. Curiosamente, las bacterias magnetotácticas (MTB) son ejemplos típicos de organismos que regulan sus propias funciones biológicas utilizando materiales magnéticos13,14. La MTB presenta orgánulos conocidos como magnetosomas que contienen nanopartículas magnéticas envueltas por bicapas lipídicas, que desempeñan un papel vital en el mantenimiento de la magnetotaxis y la supervivencia de la MTB15,16. Es de destacar que el compartimento del magnetosoma actúa como una puerta potencial para la diferenciación del pH o potencial redox entre la vesícula y el entorno celular17. Inspirados en el MTB, los compartimentos subcelulares dinámicos son favorables para la integración de materiales, ya que pueden proteger la eliminación biológica mientras mantienen una estabilidad relativa en el entorno intracelular, lo que representa un elemento clave para la modificación del organismo. Sin embargo, aunque la evolución de los organismos basada en materiales ha atraído un amplio interés interdisciplinario, las estrategias necesarias para fabricar los orgánulos integrados en materiales antes mencionados siguen sin explotarse adecuadamente.

Los protistas son los herbívoros más importantes de virus en ambientes acuáticos. Desempeñan papeles esenciales en el control eficaz de las aguas residuales biológicas18,19. Se han realizado intentos de utilizar ciliados para abordar los problemas del medio ambiente acuático20. Sin embargo, la susceptibilidad del virus al pastoreo por parte de protistas depende en gran medida de la especie y de la hidrofobicidad del virus21. A pesar de lo prometedor que resulta el uso de protistas para tratar virus transmitidos por el agua, sus tasas de eliminación están restringidas en menos de 4 órdenes de magnitud debido a la falta de conocimiento mecanicista. Más importante aún, debido a la baja eficiencia en la inactivación de virus, los protistas también pueden actuar como reservorio de virus para proteger los virus ingeridos del tratamiento de inactivación22, lo que aumenta el riesgo de transmisión de virus transmitidos por el agua. Según datos de la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades transmitidas por el agua causadas por virus siguen estallando en todo el mundo a pesar de décadas de desarrollo de tecnologías de filtración y desinfección por membrana23, como la ósmosis inversa (RO), la ultrafiltración (UF), la nanofiltración (NF) y la cloración/ UV/ozono (Tabla complementaria 1)24,25,26,27. A diferencia de las técnicas convencionales, proponemos el diseño de un orgánulo eliminador de virus (VSO) bioartificial para dotar a los protistas de la capacidad de capturar y eliminar específicamente virus transmitidos por el agua.

Usamos Paramecium caudatum (Para), un ciliado unicelular de vida libre, como modelo, porque Para puede reproducirse, nadar en agua viscosa y pastar y consumir clorovirus como alimento, evitando al mismo tiempo la producción de subproductos tóxicos y altos costos de energía28. 29. Sin embargo, aunque algunos estudios informaron que Para puede ingerir ciertos tipos de virus, la capacidad de captura y eliminación de virus es específica del virus y menos efectiva22,28,29. Por lo tanto, es imposible utilizar directamente Para o protistas como estrategia para eliminar virus. Aquí, aprovechamos el proceso de ingesta de alimentos de Para30 para permitir la construcción de orgánulos subcelulares artificiales dentro de Para31,32. En consecuencia, diseñamos una nanopartícula magnética de Fe3O4 modificada con un anticuerpo dirigido a virus (MNPs@Ab, Fig. 1a) e integramos MNPs@Ab en vacuolas a través de un proceso de alimentación para introducir un orgánulo eliminador y dirigido a virus específico (VSO, Fig. 1b). ). Los módulos VSO obtenidos tuvieron una larga vida útil dentro del Para (E-Para) diseñado y permitieron la captura de virus mediante la presencia de anticuerpos específicos en VSO mediante la fusión de vacuolas cargadas de virus y VSO (Fig. 1c). Dentro de los VSO, el ambiente ácido que contenía una gran cantidad de peróxido de hidrógeno (H2O2) estimuló la actividad similar a la peroxidasa de las MNP33 y generó radicales hidroxilo a través de la reacción de Fenton34, lo que llevó a una desactivación eficiente de los virus. Después de capturar los virus, los E-Para se recolectaron eficientemente con un imán externo para minimizar la contaminación ambiental (Fig. 1d). Para lograr un VSO versátil para la eliminación de virus genéricos, los anticuerpos en MNPs@Ab fueron reemplazados por virus que capturan ácido siálico, que roza simultáneamente tres tipos diferentes de virus en agua, lo que refleja la universalidad de esta estrategia. El E-Para elimina virus patógenos del agua ambiental, lo que representa un biorobot prometedor para controlar enfermedades transmitidas por el agua y purificar el agua ambiental. Nuestros hallazgos proporcionan un nuevo concepto para promover la evolución funcional de organismos vivos con orgánulos semiartificiales diseñados mediante nanomateriales funcionales.

a Preparación de MNPs@Ab. b La formación de VSO después de la ingeniería de Para utilizando MNPs@Ab. c El mecanismo propuesto de captura e inactivación de virus por E-Para. La captura de virus por parte de E-Para involucra cuatro procesos: 1. Ingestión de virus; 2. Formación de vacuolas alimentarias que contienen virus; 3. Fusión de vacuolas alimentarias; 4. Captura de virus por MNPs@Ab. La inactivación del virus por E-Para se mostró como 5. Inactivación del virus. d Recuperación magnética de E-Para.

Se sintetizaron nanopartículas magnéticas (MNP) de Fe3O4 mediante un método solvotérmico utilizando citrato de sodio como modificador. Los espectros de difracción de rayos X en polvo (pXRD) confirmaron la cristalinidad de las MNP obtenidas (Figura 1 complementaria). Dado que la química de la superficie de las MNP puede influir en su estabilidad en Para y su citotoxicidad hacia Para, empleamos citrato de sodio y polímeros, incluidos polietilenimina (PEI), polietilenglicol (PEG) y ácido poliacrílico (PAA), para modificar las MNP, que Luego se incubaron con Para durante 2 h. Como lo indica el contenido de Fe restante dentro del Para (Figura 2 complementaria) y el ensayo de citotoxicidad (Figura 3 complementaria), el Fe3O4 modificado con citrato de sodio (Fe3O4@citrato de sodio) permitió una retención in vivo eficiente y mostró menos citotoxicidad que los otros modificadores. Por tanto, se añadió citrato trisódico dihidrato durante la síntesis de las MNP antes de la modificación del anticuerpo. El recubrimiento exitoso de citrato de sodio sobre la superficie de MNP se confirmó examinando los picos característicos de las vibraciones de estiramiento C-O a 1396 cm-1, las vibraciones de estiramiento C = O a 1597 cm-1 y las vibraciones de estiramiento O-H a 3416 cm-1. 1 después de la modificación mediante espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) (Figura complementaria 4). El grupo carboxi del citrato de sodio sirve como sitio reactivo para la modificación de anticuerpos. El anticuerpo monoclonal EV71 se unió a la superficie de las MNP utilizando la química de conjugación de N-etil-N′-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS). Tras la conjugación de anticuerpos, el potencial zeta de MNPs@Ab cambió de −6 a −12 mV (Figura complementaria 5).

La afinidad de unión al virus de MNPs@Ab solo se examinó primero mediante el uso de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para confirmar que MNPs@Ab podía reconocer virus. La elevada DO observada al agregar MNPs@Ab sugirió que MNPs@Ab conservó su afinidad de unión hacia EV71 (Fig. 2a). El análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostró dimensiones de MNP @ Ab con un diámetro de aproximadamente 162 nm (Fig. 2b). Además, las MNP @ Ab mostraron una magnetización de saturación de aproximadamente 62 emu / g, que fue comparable a la del control de MNP en presencia de anticuerpo (Fig. 2c).

un ELISA de MNPs@Ab confirmó la conjugación de anticuerpos. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). b Imagen TEM de MNPs@Ab y distribución de tamaño de MNPs@Ab (recuadro). c Bucles de histéresis magnética de MNP @ Ab y MNP. d, e Microscopía óptica d e imágenes TEM e de las vacuolas alimentarias en Para natural. Se amplió el área de vacuola resaltada. f, g Microscopía óptica f e imágenes TEM g de las vacuolas alimentarias de E-Para. Se amplió el área VSO resaltada. h Bucles de histéresis magnética para Para natural y E-Para. i Para la fabricación de E-Para, se cocultivaron Para con diferentes concentraciones de MNP @ Ab durante 2 h. Luego, los E-Para obtenidos se cultivaron en medio sin alimentación durante otras 24 h para la evaluación de la toxicidad. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). j Velocidades de Para y E-Para naturales. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). En i, j, la significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student de dos colas. P <0,05 se consideró significativo. Ns no significativo.

El VSO in vivo se diseñó alimentando a Para con MNPs@Ab (200 μg/mL) que contiene una solución de Dryl modificada (denominada tampón KDS, un tampón de fosfato comúnmente utilizado en estudios de Paramecium)35 durante 2 horas a 25 °C. Primero, utilizamos microscopía de contraste de fases para observar el E-Para antes y después de la incubación con MNPs@Ab. Como se muestra, Para natural mostró vacuolas transparentes mientras que E-Para mostró estructuras oscuras y aisladas similares a vacuolas dentro de las células (Fig. 2d, f), lo que indicó la entrada de MNP @ Ab durante el proceso de alimentación. Luego se utilizó TEM para verificar la distribución subcelular de MNPs@Ab. Las vacuolas de Para natural estaban casi vacías debido a la inanición (Fig. 2e), mientras que todas las vacuolas de E-Para estaban llenas con grandes cantidades de MNP @ Ab (Fig. 2g). No se observó una diferencia significativa entre el tamaño de los MNPs@Ab preparados y los MNPs@Ab ingeridos en E-Para (in vivo) (Fig. 6 complementaria), lo que indica la estabilidad de los MNPs@Ab. Además, el bucle de histéresis magnética para E-Para mostró características superparamagnéticas similares a las de MNP @ Ab, mientras que la Para natural era diamagnética (Fig. 2h). Luego, las MNP@Ab intracelulares se evaluaron cuantitativamente mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP‒MS), que mostró 30,06 ± 2,44 μg de Fe por 104 células E-Para (Figura complementaria 7). Estos resultados confirmaron la formación efectiva in vivo de VSO dentro de Para (E-Para). Además, las vacuolas cargadas de MNP @ Ab se mantuvieron estables en Para durante al menos 24 h, exhibiendo la estabilidad de VSO en E-Para (Figura complementaria 8).

Se examinó más a fondo el efecto de VSO sobre las propiedades biológicas de E-Para. Para evaluar la citotoxicidad de los VSO implantados, calculamos la tasa de supervivencia36 de Para después de la coincubación con una concentración en serie de MNP@Ab. Los resultados mostraron que MNPs@Ab exhibió una citotoxicidad minimizada para Para en concentraciones de hasta 200 μg / ml, lo que manifiesta una biocompatibilidad aceptable (Fig. 2i). Para estimar si los MNPs@Ab afectan el rendimiento atlético de Para, evaluamos la velocidad de movimiento del E-Para. En comparación con la del Para natural (Película complementaria 1), la velocidad del E-Para disminuyó ligeramente, lo que podría atribuirse al aumento de peso del Para debido a la implantación del VSO, pero no hubo una diferencia significativa según la velocidad de nado. (Fig. 2j) y dirección (Película complementaria 2). Estos resultados indicaron que el E-Para siguió siendo viable después de la ingeniería.

Luego se investigó la ingestión de virus colocando E-Para o Para (8 x 103 células) en 1 ml de EV71 (105 UFP/ml) durante 4 horas a 25 °C. Luego se observaron los virus Para y ingeridos mediante microscopía de barrido láser confocal (CLSM). Aunque se observó EV71 marcado con tinte rojo en ambos grupos, E-Para capturó más virus que el Para natural, lo que demuestra que VSO mejoró la capacidad de captura de virus (Fig. 3a, b). Además, encontramos que las señales rojas de los virus estaban completamente colocalizadas en los VSO dentro del E-Para (Fig. 3b). Las imágenes de construcción tridimensionales del E-Para también convencieron de que los virus estaban localizados dentro de las células pero no absorbidos en las superficies celulares. También utilizamos vistas transversales de E-Para para confirmar que el EV71 fue capturado por MNPs@Ab (Figura complementaria 9).

a, b Imágenes de fase y CLSM de Para a y E-Para b después de capturar el EV71. In vivo EV71 se localizó fusionando las imágenes de fase y fluorescencia. El verde representaba Para con la etiqueta CMFDA y el rojo representaba EV71 con la etiqueta AF555. c Para confirmar la capacidad de captura de virus de las MNP, MNPs@Ab, Para, Para modificada con MNP (Para-MNP), Para alimentada con anticuerpo (Para-Ab) y E-Para, se examinó el EV71 restante en el agua después del cocultivo. las muestras anteriores con EV71 durante 24 h. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). La significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student de dos colas. P <0,05 se consideró significativo. Ns no significativo. d Captura de virus dependiente del tiempo por Para y E-para. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). e Cantidad de genoma viral restante en agua contaminada con EV71 (1,5 × 105 copias/ml) después del tratamiento con diferentes cantidades de Para y E-Para durante 24 h. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). f Cantidad de genoma viral que queda en agua contaminada con EV71 (3,2 × 108 copias/ml) después del tratamiento con diferentes cantidades de Para y E-Para durante 24 horas. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). g Las reducciones log10 en los niveles del genoma viral se calcularon después de que se trataran diferentes volúmenes de soluciones de EV71 con E-Para o Para (6,4 × 104 células/ml). h Para la eliminación de virus genéricos, las MNP se modificaron con ácido siálico (SA), que simultáneamente rozó EV71, H1N1 y Ad5 de la solución, lo que refleja la versatilidad de esta estrategia. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3).

Para determinar si la captura viral dependía de los anticuerpos en las MNP, comparamos las eficiencias de captura de virus de las MNP, MNPs@Ab, Para diseñadas por MNP sin modificación de anticuerpos (Para-MNP) o Para alimentadas con anticuerpo solo (Para-Ab). ) con el de E-Para determinando el genoma viral que queda en suspensión después de 24 h de incubación. La presencia de anticuerpos en MNPs@Ab no mostró una mejora significativa en la captura del virus, ya que las MNP son inestables y tienden a agregarse en la solución, lo que lleva a una reducción de la afinidad de unión del virus (Fig. 3c). Además, para Para-Ab, Para-MNP y Para nativo, su capacidad de captura de virus se mantiene en un nivel bajo que la de E-para (Fig. 3c). Para Para-Ab, el anticuerpo no pudo alcanzar una concentración local alta en las vacuolas. Por lo tanto, los virus ingeridos no fueron retenidos eficientemente en las vacuolas y pudieron excretarse. Por el contrario, la ingestión de MNPs@Ab en VSO resultó en una retención y enriquecimiento a largo plazo de anticuerpos dentro de E-Para, lo que resultó en una alta eficiencia de captura de virus. Este resultado confirmó que la unión de anticuerpos específicos de virus a las MNP permitió significativamente la capacidad de VSO para capturar virus.

Luego se exploraron las eficiencias de captura de virus de E-para o Para a lo largo del tiempo. Para Para, de 8 a 24 h de captura condujeron a sólo una reducción de 0,8 log10 en la cantidad de genoma viral. Por el contrario, los VSO de E-Para mejoraron drásticamente la eficiencia de captura con el tiempo y finalmente condujeron a una eliminación completa del genoma viral después de 24 h (Fig. 3d). Los virus restantes en el sobrenadante también se validaron mediante análisis de inmunofluorescencia indirecta (IFA). Estos resultados mostraron que la cantidad de células de rabdomiosarcoma (RD) infectadas se redujo después del tratamiento con E-Para (Figura 10 complementaria), lo que fue consistente con los resultados de RT‒qPCR, lo que reveló que E-Para capturó el virus de manera más efectiva que Para. Estos resultados mostraron que VSO juega un papel importante en el proceso de captura de virus. El desafío actual para el control de enfermedades transmitidas por el agua es que los tamaños pequeños y las concentraciones muy bajas en el agua ambiental hacen que la eliminación de virus con dispositivos de filtrado convencionales sea extremadamente difícil. Sin embargo, descubrimos que E-para mostró una alta eficacia para capturar virus con tamaños más pequeños (aproximadamente 30 nm) y con menor concentración de una manera efectiva y respetuosa con el medio ambiente sin la necesidad de dispositivos adicionales.

El comportamiento de eliminación de virus dependiente de la dosis de E-Para mostró que EV71 a una concentración de 1,5 × 105 copias/ml fue eliminado completamente por 8 × 103 células/ml de E-Para dentro de las 24 h posteriores a la incubación (Fig. 3e). La concentración mínima necesaria para eliminar estos virus fue 8 × 103 células/ml de E-Para (Fig. 3e). Es de destacar que cuando la concentración de virus aumentó a 3,2 × 108 copias/ml, se necesitaron al menos 6,4 × 104 células/ml de E-Para para eliminar completamente estos virus, lo que indica una eliminación del virus que depende de la dosis (Fig. 3f). Por el contrario, un aumento en el nivel de Para nativo no mejoró significativamente la eliminación del virus (Fig. 3e, f), lo que fue consistente con resultados anteriores21. La infectividad de la solución contaminada con EV71 tratada con E-Para también se midió con un ensayo de formación de placas (Figura 11 complementaria). Además, la viabilidad de la captura de virus basada en VSO se determinó aumentando los volúmenes de las soluciones que contienen EV71. Con aumentos en el volumen de agua, el tratamiento con E-Para resultó en una reducción de 8 log10 en el genoma viral, superando el estándar de la OMS (valor de reducción de 4 log10) (Fig. 3g)38. Además, la eficacia de eliminación no mostró una disminución obvia cuando el volumen se elevó a 2500 ml, lo que indica una capacidad de procesamiento preferible en grandes volúmenes de agua.

La captura específica de virus basada en anticuerpos no es genérica para otros tipos de virus transmitidos por el agua. En el caso de purificar agua de una amplia variedad de virus transmitidos por el agua, también es necesario equipar el E-Para con VSO que se dirija a diferentes tipos de virus potenciales. Por lo tanto, modificamos las MNP con ácido siálico (SA), un monosacárido y un componente clave para la unión del receptor a virus como enterovirus, influenza y adenovirus39,40,41, para verificar la versatilidad de la estrategia basada en VSO. Después de la modificación de SA, el potencial zeta de las MNP @ SA cambió de 26,6 a −9,1 mV (Figura complementaria 12a). Las MNP modificadas con SA (MNPs@SA) exhibieron los picos FTIR característicos para vibraciones de estiramiento N – H a 3385 cm-1, C = O vibraciones de estiramiento a 1617 cm-1, vibraciones de flexión N-H a 1541 cm-1, C –Vibraciones de estiramiento asimétrico O – C a 1278 cm −1 y vibraciones de estiramiento simétrico C – O – C a 1068 cm −1 (Figura complementaria 12b).

Para fue diseñado por MNPs@SA de la misma manera que E-Para y recibió el nombre de E-Para-SA. El E-Para-SA se utilizó para tratar una solución que contenía EV71 (8,2 × 107 copias/ml), H1N1 (1,4 × 108 copias/ml) y Ad5 (4,6 × 107 copias/ml). Debido a la unión de los virus a los glicanos del ácido siálico, los niveles de reducción log10 para EV71, H1N1 y Ad5 por E-Para-SA fueron 6, 5 y 5 respectivamente (Fig. 3h), lo que indica virus significativamente más altos. capturando eficiencia que el Para nativo. La eficiencia de eliminación de los tres virus alcanzó el 99,99 %, es decir, más de 4 log10 copias/mL. Estos datos indicaron una capacidad genérica de captura de virus, lo que sugiere que la versatilidad de VSO puede adaptarse mediante el diseño racional de grupos funcionales en las MNP.

¿Cómo capturan los virus los VSO que contienen MNPs@Ab? Las imágenes CLSM de captura de virus por E-Para mostraron la co-localización de virus (rojo) y MNPs@Ab (imagen negra en fase) en las mismas vacuolas de E-Para (Fig. 3b). Este resultado verificó que los virus recién ingeridos ingresaron a los VSO preexistentes. Para investigar cómo los alimentos pasan de nuevas vacuolas a VSO de E-Para, incubamos E-Para (Fig. 13a, b complementaria) con Escherichia coli (E.coli) y observamos la formación de vacuolas que contenían tanto bacterias como MNP@Ab. al mismo tiempo. E. coli fue ingerida por E-Para a través del citostoma (Figura complementaria 13c) para formar una nueva vacuola alimentaria (FV) marcada en azul (Figura complementaria 13d). Encontramos vacuolas que contienen E. coli fusionadas con VSO que contiene MNP @ Ab, lo que indica el paso de alimentos por la vía de fusión de una vacuola (Figuras complementarias 13e-h). Estos resultados mostraron que la captura del virus por VSO se basa en el paso alimentario de Para, mediante el cual las vacuolas que contienen virus se fusionan con los VSO circulantes in vivo. Después de ingresar al VSO, los virus fueron capturados por anticuerpos en VSO (Fig. 3c). Si el anticuerpo no está adherido a las MNP, no pudieron quedar atrapados y concentrados dentro de las vacuolas de Para durante mucho tiempo, lo que resultó en un bajo nivel de captura de virus (Fig. 3c). Por el contrario, la retención y el enriquecimiento a largo plazo de MNPs@Ab en VSO dieron como resultado una alta concentración de anticuerpos locales en las vacuolas (Figura complementaria 8), lo que es beneficioso para la captura y atrapamiento del virus por parte de los anticuerpos dentro de VSO, mejorando así la detección del virus. eficiencia de captura de E-Para (Fig. 3c).

La inactivación del virus por E-Para se evaluó examinando la infectividad de los virus capturados por E-Para mediante ensayos de formación de placas. Después de capturar EV71 durante 24 h, los virus dentro de Para y E-Para se liberaron mediante tratamientos de lisis celular y luego se usaron para infectar células RD para determinar la infectividad restante. Como control, el tratamiento de lisis celular con el tampón de lisis SDS mostró poco efecto sobre la infectividad viral (Figura 14 complementaria). Es de destacar que los virus ingeridos por E-Para perdieron completamente su infectividad (Fig. 4a), lo que indicó que E-Para no solo capturó los virus sino que también los inactivó. Por el contrario, el título de los virus capturados por el Para natural se redujo en menos de 1 log10 PFU/ml, lo que sugiere que los virus no fueron completamente inactivados por el Para natural (Fig. 4a). Además, MNPs@Ab por sí solo no tuvo efecto virucida en el agua (Fig. 4a). La inactivación de los virus ingeridos por E-Para se acercó al 100%, mientras que el Para natural y MNPs@Ab mostraron un 70,87% y ninguna inactivación respectivamente (Fig. 4b). En conjunto, estos datos indican que los virus permanecieron infecciosos dentro de las vacuolas de Para nativo o después del tratamiento con MNPs@Ab, mientras que los VSO dentro de E-Para inactivaron completamente los virus infestados, lo que implica un efecto de desactivación sinérgico de MNPs@Ab en las vacuolas. Para protegió los virus y los genomas virales dentro de las vacuolas, que seguían siendo infecciosas. Luego investigamos si E-Para o Para inactivaron completamente el virus ingerido después de la incubación con EV71 durante 24 h. Para el Para natural, el virus ingerido siguió siendo infectivo y el genoma viral fue detectable, lo que indica el riesgo potencial de utilizar el virus natural para la captura. No obstante, para E-Para, no se detectó ningún genoma viral residual en VSO (Fig. 4c). Estos resultados indicaron que E-Para eliminaba eficazmente los virus ingeridos dentro de los VSO.

un título de Intra-Para EV71 detectado con el ensayo de formación de placas. b Eficiencias de inactivación de MNPs@Ab, Para y E-Para. c Genoma viral que permanece dentro de las células E-Para o Para después del tratamiento. d Espectros EPR de MNPs@Ab a diferentes valores de pH. e Comparación de las capacidades catalíticas de MNPs@Ab, Para natural y E-Para con TMB. f La capacidad catalítica dependiente de la dosis de E-Para. g Imágenes de fluorescencia de Para y E-Para teñidas con ROSGreenTM (una sonda de H2O2 con fluorescente verde). h Contenidos de H2O2 en Para y E-Para. i Intensidad de fluorescencia de •OH medida por ImageJ. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). j, k Imágenes de fluorescencia de Para j y E-Para k teñidas con HPF (una sonda •OH con fluorescente verde). Las imágenes de los cuadros amarillos están parcialmente ampliadas (barra, 20 μm). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando la prueba t de Student de dos colas (a, b, e) o análisis de varianza de dos vías (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey c. P <0,05 se consideró significativo. Ns no significativo.

Dado que el óxido férrico tiene actividad similar a la peroxidasa en ambientes de pH ácido, el MNPs@Ab en los VSO es capaz de generar radicales hidroxilo (•OH) catalizando peróxido de hidrógeno (H2O2) a través de una reacción similar a Fenton34. •El OH puede inactivar virus porque reacciona con casi todo tipo de biomoléculas, como lípidos y nucleótidos42,43. Para investigar la actividad similar a la peroxidasa de MNPs@Ab in vitro, se utilizó espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR). A pH 3,5, MNPs@Ab mostró señales EPR dependientes de la dosis más fuertes (1:2:2:1) con DMPO/•OH (Fig. 15 complementaria) en presencia de H2O2 que sin H2O2 añadido (Fig. 4d). . Sin embargo, no se detectó ninguna señal de •OH a pH 7,4 para MNPs@Ab o la mezcla de MNPs@Ab y H2O2 (Fig. 4d). Por lo tanto, en soluciones ácidas que contienen H2O2, los MNPs@Ab generaron •OH altamente reactivo.

Para verificar la capacidad antiviral del •OH inducido por MNPs@Ab in vitro, incubamos MNPs@Ab (200 μg/mL) con EV71 en presencia de H2O2 (1 mM) a diferentes pH durante 24 h y examinamos el título restante. de EV71 mediante ensayo de placa. En soluciones ácidas que contienen H2O2, la infectividad de EV71 se redujo efectivamente mediante MNPs@Ab (Fig. 16 complementaria), debido a la generación de •OH altamente reactivo (Fig. 4d y Fig. 15 complementaria). Por el contrario, a pH 6, 7 y 8, MNPs@Ab no pudo inactivar EV71.

También probamos la actividad similar a la peroxidasa de MNPs@Ab dentro de los VSO in vivo. La 3,3,5,5-tetrametilbencidina (TMB), un sustrato de la peroxidasa, reacciona con óxido férrico en presencia de H2O2 en condiciones ácidas para desarrollar un color azul con una absorbancia máxima a 652 nm33. Por lo tanto, agregamos TMB al búfer KDS que contiene E-Para para buscar el producto azul. Como se esperaba, tanto las células Para como las E-Para produjeron un catalizador azul in vivo (Fig. 17 complementaria), mientras que la absorbancia a 652 nm para E-para tratada con TMB fue evidentemente más fuerte que la del Para natural (Fig. 4e). lo que indica que se produjo una reacción catalítica reforzada dentro de E-Para. En particular, la actividad enzimática aumentó a medida que aumentó la concentración de MNPs@Ab, lo que confirma que el efecto catalítico estaba realmente relacionado con MNPs@Ab en los VSO (Fig. 4f).

Para inspeccionar la presencia de H2O2 dentro de Para, ROSGreenTM, se utilizó una sonda especial de H2O2 que emite fluorescencia verde al entrar en contacto con el H2O2. Tanto Para como E-Para exhibieron la presencia de H2O2 intracelular (Fig. 4g), que se derivaba principalmente de lisosomas o peroxisomas en el citoplasma44. Debido a la presencia de MNP @ Ab, los niveles de H2O2 en los VSO aumentaron más rápidamente que con Para dentro de las primeras 8 h, y luego disminuyeron más rápido que con Para, lo que sugiere un consumo acelerado de H2O2 (Fig. 4h).

Se han realizado extensos estudios que ilustran que la vacuola alimentaria de Para pasa por un período con pH ácido 30,32,45, que, junto con el H2O2 dentro de la vacuola, crea condiciones favorables para la reacción entre Fe (II) y H2O2 que produce •OH. . Usamos 3′-(p-hidroxifenil)fluoresceína (HPF) para rastrear la formación de •OH. Curiosamente, se observaron más vacuolas fluorescentes verdes agregadas en E-Para preparado (Fig. 4k) que en Para natural (Fig. 4j) a las 0 h, verificando la rápida producción de •OH dentro de los VSO. Luego, la producción de •OH mejoró significativamente en E-Para 8 horas después de la ingeniería VSO, lo que indica la producción de grandes cantidades de •OH en los VSO (Fig. 4i). A partir de entonces, la cantidad de •OH comenzó a disminuir, probablemente debido al consumo de •OH durante el proceso de inactivación del virus. La colocalización de MNPs@Ab intracelular y la señal de fluorescencia de OH confirmaron el papel crucial de MNPs@Ab en la generación de OH dentro de las vacuolas (Fig. 4k).

Estos fenómenos indicaron que los VSO en E-Para dieron como resultado un nivel continuamente más alto de •OH que el Para nativo, lo que provocó daño redox al virus ingerido. Juntos, los VSO utilizaron la interacción sinérgica entre MNPs@Ab y el entorno de la vacuola para lograr una producción sostenida de •OH, lo que permitió una inactivación eficiente del virus.

En el caso de problemas de bioseguridad causados por E-Para capturado por virus en el agua, es esencial recuperar el E-Para usado después del tratamiento. Sin embargo, los Para son difíciles de recolectar mediante métodos de recolección convencionales debido a su excelente movilidad. El E-Para implantado con VSO se recuperó fácilmente de la solución acuosa mediante un imán externo (Fig. 5a) y volvió a moverse libremente después de que se retiró el imán (Película complementaria 3), lo que confirma que la recuperación magnética no tuvo un efecto significativo sobre la actividad de E-Para. Además, eliminamos E-Para con paraformaldehído al 4% y descubrimos que el E-Para muerto mostraba una característica superparamagnética similar a la de MNPs@Ab, lo que indica que el E-Para muerto también es reciclable debido al VSO (Fig. 2h). La eficiencia de recuperación magnética de E-Para se relacionó con la concentración de MNP @ Ab en VSO (Fig. 5b). Además, la recuperación magnética de E-Para de varios volúmenes de solución no se vio afectada por el aumento del volumen de agua, lo que indica la disponibilidad de eliminación de E-para sin la necesidad de un tratamiento adicional de la solución (Fig. 5c).

a Recuperación de Para y E-Para con un imán. Las imágenes fueron recogidas con un estereomicroscopio. b Efecto de la concentración de MNP @ Ab incorporada sobre la recuperación magnética del E-Para. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). c Efecto del volumen de solución sobre la recuperación magnética de E-Para. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). d Reutilización de E-Para. Los datos se presentan como la media ± DE (n = 3). En b, cyd, la significación estadística se calculó mediante la prueba t de Student de dos colas. P <0,05 se consideró significativo. Ns no significativo.

Sin embargo, la variación del magnetismo de E-Para a lo largo del tiempo mostró una ligera disminución en la magnetización de saturación de 3,4 a 1,7 emu/g en 24 h (Figura complementaria 18a). El contenido de Fe en el E-Para siguió disminuyendo dentro de las 72 h (Figura complementaria 19a), lo que condujo a la reducción de la magnetización de saturación. Sin embargo, la reducción de MNP tuvo un impacto insignificante en la tasa de recuperación magnética de E-Para en 24 h (Figura complementaria 18b). Además, cuando E-Para se cultivó en medio de inanición con el tiempo, su viabilidad comenzó a disminuir después de 24 h (Figura complementaria 19b), lo que indica toxicidad a largo plazo de MNP @ Ab en Para. La proliferación de E-Para también debe restringirse mediante el uso de un medio de inanición para evitar la reducción de VSO causada por la división de E-Para (Figura complementaria 19c). En conjunto, para evitar una mayor pérdida de reciclabilidad, el tiempo de captura del virus debe limitarse a 24 h.

Luego, los E-Para reciclados se cultivaron en un medio de crecimiento suplementado con E. coli para continuar con la proliferación de Para (Figura complementaria 19d). Para evitar la disminución de MNPs@Ab en células individuales (Fig. 19c complementaria), se rediseñó Para proliferado con MNPs@Ab para restaurar los VSO antes de su reutilización. El E-Para reactivado aún resultó en una reducción de 8 log10 en los niveles del genoma viral después de diez ciclos (Fig. 5d), lo que indica la viabilidad de reciclar y reutilizar este sistema. Estos resultados muestran que los VSO magnéticos permitieron la recuperación eficiente de E-Para con un campo magnético, lo que facilitó la reutilización y evitó el riesgo de infección, garantizando así el respeto al medio ambiente y la bioseguridad de esta estrategia.

El punto clave de nuestro diseño es obtener una plataforma biológica de eliminación de virus basada en MNP basada en Para vivo. La incorporación de nanopartículas magnéticas de Fe3O4 modificadas en Para mediante el proceso de ingestión de alimentos es simple y eficiente. Las nanopartículas de Fe3O4 con modificadores adecuados muestran biocompatibilidad en Para diseñado en una concentración razonable y se integran con vacuolas alimentarias de Para para formar un orgánulo bioartificial funcionalizado. El mecanismo subyacente de captura de virus por E-Para está relacionado con el uso de MNPs@Ab para intervenir en el proceso de ingestión, paso y digestión de alimentos. Primero, los orgánulos de vacuolas alimentarias (VSO) que eliminan virus se formaron después de alimentar a Para nativo con MNPs@Ab durante 2 h a través de una vía de ingesta de alimentos, mediante la cual las MNPs@Ab entraron y se retuvieron dentro de las vacuolas alimentarias durante al menos 24 h. En línea con estos resultados, un informe anterior también muestra que los nanomateriales inorgánicos se pueden cargar directamente en las vacuolas de Para a través de un surco ciliado30. Los nanomateriales ingeridos, como los puntos cuánticos (QD), detienen la digestión y egestión de las vacuolas que contienen nanopartículas46, manteniendo así una larga vida útil dentro de las vacuolas. Además, Para puede acumular e ingerir partículas de alimentos a través de sus citostomas y formar vacuolas para circular por el cuerpo a lo largo de un camino definido en el endoplasma llamado ciclosis30. Por lo tanto, los VSO con una vida útil prolongada pueden circular en E-Para durante al menos 24 h, lo que es beneficioso para la posterior captura del virus. Entonces, ¿cómo ingresa el virus a los VSO que contienen MNP@Ab? Observamos la fusión dinámica de membranas y el intercambio de sustancias entre vacuolas alimentarias recién formadas que contienen E. coli y VSO circulantes (Figura complementaria 13). De manera similar, el virus también puede colocarse con MNPs@Ab. En conjunto, estos datos verifican que el virus puede pasar al VSO de E-Para mediante la fusión de nuevas vacuolas con vacuolas antiguas que indican una vía de paso de alimentos (Fig. 1c). Después de ingresar al VSO, el virus puede ser reconocido y capturado por las MNP que se unen a los anticuerpos. Para el Para nativo, el virus no puede retenerse eficientemente dentro de las vacuolas alimentarias y, por lo tanto, excretarse22. El uso de MNP difíciles de descargar para administrar anticuerpos a las vesículas alimentarias ayuda a evitar la descarga rápida de anticuerpos y, por lo tanto, puede retener y enriquecer los anticuerpos en las vesículas alimentarias. Como tal, la eficiencia de captura de virus de E-Para mejoró significativamente. Creemos que la capacidad de captura de virus de E-Para está determinada principalmente por la ubicación y la alta concentración local de anticuerpos. La ingestión de partículas de material basada en vacuolas es común en protozoos unicelulares y podría desarrollarse como una estrategia de modificación general.

La ventaja de utilizar orgánulos semiartificiales con actividad similar a la peroxidasa es que el peróxido de hidrógeno y los ambientes ácidos en las vacuolas de los alimentos eran estables y constantes. Un suministro continuo de peróxido de hidrógeno mejoró significativamente el efecto catalítico de las MNP, permitiendo a las nanozimas producir •OH. Por tanto, la eficacia de la inactivación in vivo fue significativamente mayor que la observada en el entorno in vitro. A diferencia de otros métodos de desinfección tradicionales, el Para que lleva VSO captura virus y los inactiva sin necesidad de tratamiento desinfectante adicional. Por otro lado, nuestro resultado mostró que el Para nativo fue capaz de matar el 70,87% del virus capturado. La literatura anterior22 informa que Para inactiva el virus ya sea mediante la producción de metabolitos que afectan negativamente al virus o digiriéndolo directamente como alimento. Como tal, además de mejorar la producción de •OH por parte de MNPs@Ab, el Para natural también mató al virus por su capacidad intrínseca.

Para evitar la contaminación secundaria, recuperamos E-Para después de la incubación con el virus durante 24 h con un imán y los reutilizamos nuevamente. La tasa de supervivencia de E-Para fue de aproximadamente el 99% en 24 h, lo que garantiza la captura e inactivación eficaz del virus. No se recomienda extender el tiempo de captura ya que la viabilidad y las características superparamagnéticas de E-Para se redujeron con el tiempo, lo que aumentó el riesgo de fuga de virus. En caso de que el E-Para no pueda eliminarse por completo del agua, el E-Para restante no causará contaminación del agua ambiental ya que Para no es un patógeno patógeno e incluso puede eliminar microorganismos dañinos19,29 y contaminantes47,48 del ambiente acuático. Para la purificación del agua potable, el E-Para que queda en el agua puede proliferar y convertirse en contaminantes. Sin embargo, la eliminación de Para es más fácil que la eliminación de virus transmitidos por el agua, por lo que se puede utilizar el procedimiento general de purificación del agua potable para la purificación.

El VSO basado en anticuerpos solo captura virus que pueden ser reconocidos por anticuerpos. Sin embargo, la estrategia específica para virus basada en anticuerpos no es genérica para otros tipos de virus transmitidos por el agua. En el caso de purificar agua de una amplia variedad de virus transmitidos por el agua, es necesario equipar el E-Para con VSO que se dirija a diferentes tipos de virus potenciales. Por lo tanto, diseñamos el Para con MNPs@SA para apuntar a más virus potenciales, ya que SA es un receptor bien identificado para múltiples virus, como enterovirus, influenza y adenovirus. Para modificado con VSO que contiene MNPs@SA elimina EV71, H1N1 y Ad5 en un 99,99%, lo que indica la versatilidad de VSO. Los VSO basados en anticuerpos o basados en SA lograron reducciones de más de 4 log10 en los niveles del genoma viral, superando el estándar de la OMS38.

Como estudio de prueba de concepto, aún queda mucho trabajo por hacer antes de su aplicación práctica. Según nuestro conocimiento actual, es necesario abordar más a fondo varias cuestiones para garantizar una aplicación exitosa, como el costo y la capacidad de captura de virus de espectro más amplio. Además, las investigaciones diseñadas para evaluar la bioseguridad a largo plazo del agua tratada con E-Para son de crucial importancia. El Para diseñado mediante orgánulos artificiales dota a la eliminación e inactivación de virus de una alta eficiencia, un bajo consumo de energía y una contaminación ambiental mínima.

En resumen, diseñamos un orgánulo semiartificial eliminador de virus para dotar a Para de la capacidad de capturar el virus, desactivarlo y recuperar el virus capturado. Los VSO personalizados son compartimentos derivados de vacuolas compuestos de nanopartículas magnéticas de Fe3O4 que se unen al virus y que circulan dentro de Para, ya que las nanopartículas inorgánicas bloquean la digestión y la egestión de los VSO. El E-Para sirvió como una “microfábrica” eficiente para inactivar el virus in situ a través de una vía de catálisis similar a una enzima, mediante la cual el VSO produjo grandes cantidades de radicales hidroxilo para matar los virus capturados. A diferencia de las tecnologías convencionales que utilizan filtración de alta presión y tratamiento químico perjudicial, nuestra estrategia utiliza microorganismos dirigibles diseñados con materiales para recolectar y eliminar virus, lo que requiere una energía mínima y es respetuoso con el medio ambiente. En general, nuestro estudio es prometedor para la modificación funcional de microorganismos mediante el diseño de un orgánulo artificial basado en nanotecnología, que es de considerable importancia para la promoción de la evolución biológica basada en materiales.

FeCl3·6H2O (99%), PEI (MW ~ 2500), PEG (MW ~ 2000) y PAA (MW ~ 3000) y ácido siálico se adquirieron de Aladdin (Shanghai, China). El citrato trisódico dihidrato y la BSA se adquirieron en MACKLIN (Shanghai, China). EDC, NHS, DMPO y el anticuerpo monoclonal anti-ratón EV71 se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). El tinte Alexa Fluor 555, Celltracker Green CMFDA y el anticuerpo secundario de alta adsorción cruzada IgG anti-ratón de cabra (H + L) conjugado con Alexa Fluor Plus 555 se adquirieron de Thermo Fisher (Waltham, EE. UU.). Se adquirió un kit de ADN/ARN del virus TIANamp (n.º DP315) de Tiangen Biotech (Beijing, China). Se adquirió un kit II de PCR One-Step TB Green PrimeScriptTM RT (#RR086A) de TaKaRa (Beijing, China). La solución de sustrato de un solo componente TMB (PR1200) se adquirió de Solarbio (Beijing, China). La lisis por SDS se adquirió de Beyotime (Shanghai, China). La sonda ROSGreenTM H2O2 se adquirió de Maokang Biotechnology (Shanghai, China). HPF se adquirió de AAT Bioquest (Sunnyvale, EE. UU.).

Los cultivos de Paramecium caudatum se mantuvieron en medio de jugo de lechuga que contenía E. coli. como alimento. La preparación del medio de jugo de lechuga fue la siguiente49,50: se lavaron hojas frescas de lechuga y se sumergieron en agua hirviendo durante unos minutos y luego se colocaron en agua fría para enfriar. A continuación, las hojas se trataron repetidamente con el exprimidor y se exprimieron con una gasa. Para usarlo como medio, el jugo se diluyó 1:40 con tampón KDS (C6H5Na3O7·2H2O 2 mM, KH2PO4 0,6 mM, Na2HPO4 1,4 mM, CaCl2 1,5 mM) y se incubó con E. coli durante 24 h. Para se cultivaron en una incubadora a temperatura constante a 25 °C.

Brevemente, primero se disolvieron FeCl3·6H2O (0,1 M) y citrato trisódico dihidrato (50 mM) en etilenglicol (30 ml); después, se añadió NaAc (1,8 g) con agitación. La mezcla se agitó vigorosamente durante 30 minutos y luego se selló en un autoclave de acero inoxidable revestido de teflón (50 ml de capacidad). El autoclave se calentó a 200 °C, se mantuvo durante 10 h y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente51,52,53. Los productos negros se lavaron con etanol y agua desionizada varias veces.

La síntesis de Fe3O4@PEI, Fe3O4@PEG y Fe3O4@PAA fue similar a la de las MNP, excepto que el estabilizador era PEI, PEG o PAA en lugar de citrato de sodio.

El MNPs@Ab se preparó conjugando el anticuerpo monoclonal EV71 con los MNP. La conjugación se realizó mediante la estrategia N-etil-N′-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS)54,55. En detalle, se mezcló 1 ml de MNP (5 mg/ml) con EDC (0,1 M) y NHS (0,7 M) durante 1 hora a temperatura ambiente. Los reactivos restantes en la reacción de acoplamiento se eliminaron mediante un imán. Posteriormente, las nanopartículas se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y finalmente se resuspendieron en 1 ml de PBS. A continuación, se agregaron 100 µl de solución de anticuerpo EV71 (1:100) a la suspensión de nanopartículas activadas y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Cualquier exceso de anticuerpo EV71 no conjugado también se eliminó mediante un imán. Se usó BSA (1%) para bloquear los sitios activos no específicos.

Se recogieron Para del medio de jugo de lechuga que contenía E. coli, se lavaron tres veces con KDS para eliminar la E. coli y luego se resuspendieron en KDS. Se agregaron doscientos microlitros de MNPs@Ab (1 mg/mL) a 800 μL de solución Para (concentración final de células: 8 × 103 a 6,4 × 104 células/mL) para alcanzar una concentración final de 200 μg/mL y luego se coincubaron. con Para durante 2 h a 25 ° C para construir E-Para. Luego, los E-Para se recogieron mediante un imán y se resuspendieron en KDS antes de su posterior procesamiento.

Se recogieron Para del medio de crecimiento y se transfirieron a tampón KDS. Luego, se agregaron diferentes concentraciones de MNPs@Ab al medio de cultivo Para para alcanzar concentraciones finales de 100, 200, 400, 800 y 1600 μg/mL durante 2 h. Luego, los E-Para obtenidos se incubaron durante 24 h a 25 °C. Las células viables y no viables se contaron manualmente utilizando un estereomicroscopio (SZMN, SUNNY OPTICAL, China). Aquellos Para que estaban inmóviles y no conservaban su forma típica eran considerados muertos. Los experimentos de control se realizaron utilizando tampón KDS sin ninguna adición de MNPs@Ab. La tasa de supervivencia (%) se calculó de la siguiente manera36:

donde N2 es el número de Para o E-Para vivos después de la incubación durante 24 horas y N1 es el número total de Para o E-Para al inicio del experimento.

Se incubó E-Para (8 × 103 a 6,4 × 104 células/ml) con solución de virus (los volúmenes de los sistemas utilizados en este estudio fueron 1 ml a menos que se indique lo contrario) durante 24 h a 25 °C. Luego, el E-Para que contenía el virus se eliminó mediante separación magnética. El genoma viral de las soluciones de virus antes y después del tratamiento con E-Para se analizó mediante ensayo RT-qPCR. Los cebadores utilizados para RT‒qPCR se enumeran en la Tabla complementaria 2.

El valor de reducción logarítmica resultante del tratamiento con E-Para se calculó de la siguiente manera56:

donde I0 es la concentración del virus antes del tratamiento (copias/mL) e If es la concentración del virus después del tratamiento.

Se agregaron cien microlitros de solución de virus a 500 μl de solución tampón NaHCO3-Na2CO3 preparada previamente (pH = 9,0), seguido de 6 μl de solución de tinte AF555 disuelta en DMSO. La solución mixta obtenida se inyectó en una bolsa de diálisis y se colocó en solución salina normal durante 48 h a 4 °C.

Se añadió solución de tinte Cell Tracker™ Green CMFDA (1 µl) a 1 ml de solución concentrada de E-Para. La solución mixta obtenida se incubó durante 30 min a 25 °C. Los E-Para y Para teñidos se lavaron tres veces con KDS para eliminar el exceso de tinte.

Los E-Para o Para teñidos se coincubaron con virus teñido durante 4 h a 25 °C y se fijaron con paraformaldehído (4%) durante 12 h a 4 °C. Las imágenes de fluorescencia fueron recopiladas por CLSM (BX61, Olympus, Japón) con el software FV1000-ASW (Versión 4.1).

La infectividad de EV71 en solución y en Para se evaluó mediante ensayos de formación de placas en células RD. Para EV71 en solución, las soluciones de virus se diluyeron en PBS en una serie de diluciones de 1:10. Se sembraron células RD en una placa de 12 pocillos durante 48 h y luego se infectaron las células con 1 ml de diluciones virales 10 veces mayores durante 1 h a 37 °C. Para EV71 en E-Para y Para, el virus que contenía Para se lisó a una concentración de 1:10 en tampón de lisis SDS y KDS durante 10 minutos para liberar el virus en Para, y luego la solución de virus resultante se diluyó 10 veces. para infectar las células RD durante 1 h a 37 ° C. Los sobrenadantes virales se reemplazaron con DMEM que contenía agarosa de bajo punto de fusión (1%) y FBS (2%). Luego, las células se incubaron a temperatura ambiente durante 20 minutos para solidificarse y luego se incubaron a 37 °C durante otros 4 a 5 días. Luego, las células se fijaron con formaldehído (4%) durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido de tinción con solución de cristal violeta (1%) durante 15 minutos. Finalmente, se fotografiaron y contaron todas las placas visibles y se calcularon los títulos finales en consecuencia.

•El OH generado por la reacción tipo Fenton entre MNPs@Ab y H2O2 se detectó mediante un espectrómetro EPR (A300, Bruker, EE. UU.) con el software Bruker Biospin WinEPR (Versión 4.40.11.65) a temperatura ambiente. Se utilizó 5,5-dimetil-1-pirrolina-N-óxido (DMPO) como trampa giratoria para la detección de •OH. Luego, se agregaron 100 µL de DMPO (0,15 M) a 50 µL de solución MNPs@Ab y se detectaron inmediatamente después de la adición de 50 µL de H2O2 (10 M). Sólo se utilizaron como controles H2O2 y MNPs@Ab. Los ajustes de los parámetros de medición del EPR fueron los siguientes: potencia de microondas de 20,5 mW, rango de escaneo de 120 G y modulación de amplitud de 2 G.

Se agregaron cien microlitros de solución de sustrato de componente único de TMB a 900 µl de KDS que contenía Para (8 x 103 células/ml). La mezcla de TMB y E-Para se incubó durante 20 min a 25 °C en la oscuridad. Las fotografías se recolectaron con un microscopio de fluorescencia invertido (IX73, Olympus, Japón).

Se agregaron cien microlitros de solución de sustrato de componente único de TMB a 900 μl de KDS que contenía Para (8 x 103 células/ml) o 900 μl de solución MNPs@Ab (200 μg/ml). La mezcla de TMB y E-Para se incubó durante 20 min a 25 °C en la oscuridad, y luego se agregaron 100 μL de tampón de lisis SDS y se incubó durante otros 10 min. Luego, se agregaron 100 μl de la solución mixta anterior a una placa de 96 pocillos y se midió la absorbancia a 652 nm mediante un lector de microplacas (Synergy H1, BioTek, EE. UU.) con el software Gen5 (versión 3.08). Se formaron tres grupos paralelos para cada muestra.

ROSGreen™ midió los niveles de H2O2 intracelular de E-Para y Para. Brevemente, se agregaron 500 μL de sonda ROSGreen™ H2O2 (10 μΜ) a 500 μL de KDS que contenía Para (8 x 103 células/mL) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de eso, los Para se fijaron con paraformaldehído (4%) durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con KDS y se observaron mediante el canal FITC de un microscopio de fluorescencia invertido (IX73, Olympus, Japón).

Se añadieron cincuenta microlitros de sonda ROSGreen™ H2O2 (10 μΜ) a 50 μl de KDS que contenía Para (8 x 103 células/ml) y se incubaron en una placa negra de 96 pocillos con fondo transparente durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. . Se formaron cuatro grupos paralelos para cada muestra. La intensidad de la fluorescencia se midió y registró mediante un lector de microplacas de fluorescencia (Synergy H1, BioTek, EE. UU.) con el software Gen5 (Versión 3.08) a 490 nm de excitación y 525 nm de emisión. KDS se utilizó como control. El nivel de H2O2 intracelular se calculó de acuerdo con el valor de fluorescencia y la curva estándar de H2O2 (Figura complementaria 20).

Los niveles intracelulares de •OH de E-Para y Para se midieron mediante HPF. Brevemente, se agregaron 500 µl de una solución de trabajo de HPF (20 µM) a 500 µl de KDS que contenía Para (8 x 103 células/ml) y se incubaron durante 45 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de eso, E-Para y Para se fijaron con paraformaldehído (4%) durante 1 h a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con KDS. Luego, se observaron E-Para y Para mediante el canal FITC de un microscopio de fluorescencia invertido (IX73, Olympus, Japón).

La intensidad de fluorescencia de HPF se midió con el software ImageJ (Versión 1.51j8, EE. UU.).

El virus que contenía E-Para se recogió con un imán. La cantidad de E-Para recolectada por fuerza magnética y la cantidad total de E-Para se registraron manualmente con un estereomicroscopio (SZMN, SUNNY OPTICAL, China). La eficiencia de recuperación magnética de E-Para se calculó según la siguiente fórmula:

donde M2 es el número de E-Para recolectados por la fuerza magnética y M1 es el número total de Para.

Los E-Para recuperados se cultivaron durante 24 h en un medio de alimentación que contenía E. coli. Luego, estos E-Para recuperados se incubaron con MNPs@Ab (200 μg/ml) durante otras 2 h para desarrollar VSO y se liberaron para tratar 1 ml de agua que contenía virus (~ 108 copias/ml) nuevamente. El genoma del virus restante después del tratamiento con E-Para se midió mediante RT-qPCR y se calculó el valor de reducción del genoma Log10.

La significación estadística se evaluó mediante la prueba t de Student de dos colas no pareada o análisis de varianza bidireccional (ANOVA) con la prueba de comparación múltiple de Tukey como se describe en las leyendas de las figuras. Se repitieron tres experimentos independientes para obtener imágenes representativas (Figs. 2b, d – g, 3a, b, 4g, j, k; y Fig. complementaria 8-10, Fig. complementaria 13a – h, Fig. complementaria 17a, b , Figura complementaria 19c).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos fuente generados en este estudio se proporcionan en el archivo de datos fuente. El conjunto de datos de imágenes completo está disponible a pedido de los autores correspondientes. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Shuangshuang Liu de la plataforma central de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang por el apoyo técnico en el análisis CLSM. Agradecemos a Xiaoyan Miao de las instalaciones centrales del laboratorio clave de investigación biomédica oral de la provincia de Zhejiang, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, por su asistencia técnica en el sistema de liofilización. Agradecemos a Siqi Wu del Departamento de Física de la Universidad de Zhejiang por su ayuda con la caracterización de MPMS. Agradecemos a Jiaojiao Wang del Centro de Análisis de Agrobiología y Ciencias Ambientales de la Universidad de Zhejiang por su asistencia técnica en ICP-MS. Agradecemos a Xiaomin Zhang, Weilan Wang, Nianhang Rong y Xi Zheng del Laboratorio de análisis de bioultraestructura del Centro de análisis de agrobiología y ciencias ambientales de la Universidad de Zhejiang por la asistencia técnica en la preparación de secciones ultrafinas y la caracterización mediante microscopía electrónica. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (22037005 (RT) y 21625105 (RT)) y los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (2022ZJJH02-01 (RT)).

Departamento de Química, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Yihao Cui, Jiake Lin, Yuemin Zhou, Shuling Tang, Ying Zhang, Haibin Hao y Ruikang Tang

Departamento de Cardiología, Hospital Sir Run Run Shaw, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Haibin Hao, Zihao Nie, Xiaoyu Wang y Ruikang Tang

Academia Qiushi de Estudios Avanzados, Universidad de Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Haibin Hao, Zihao Nie, Xiaoyu Wang y Ruikang Tang

Laboratorio clave de intervención cardiovascular y medicina regenerativa de la provincia de Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, China

Huixin Li, Ying Zhang, Zihao Nie y Xiaoyu Wang

Laboratorio de Virología, Beijing Laboratorio Clave de Etiología de Enfermedades Virales en Niños, Instituto Capital de Pediatría, Beijing, China

Yanpeng Xu

Escuela de Química e Ingeniería Química, Universidad de Nantong, Nantong, Jiangsu, China

Yang Wang

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HL, XW y RT concibieron el proyecto y dirigieron la investigación. HL, YX, YC, JL, YZ, ST y ZN diseñaron y realizaron los experimentos y analizaron los resultados. YW ayudó con la síntesis del material. HL, YZ y HH participaron en el análisis de los datos y la interpretación de los resultados. HL y XW escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Xiaoyu Wang o Ruikang Tang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Kapil Moothi, Zhi Zhou y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Li, H., Xu, Y., Wang, Y. et al. Microorganismos bioartificiales diseñados con materiales que permiten la eliminación eficiente de virus transmitidos por el agua. Nat Comuna 14, 4658 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40397-5

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Recibido: 10 de agosto de 2022

Aceptado: 26 de julio de 2023

Publicado: 03 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40397-5

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